原生質(zhì)體融合構(gòu)建增香型獼猴桃酒酵母的研究.pdf

1、中國是世界上獼猴桃生產(chǎn)大國,但鮮果加工業(yè)相對落后,造成農(nóng)民賣果難.獼猴桃酒營養(yǎng)豐富,對人體具有多種保健作用.充分利用獼猴桃資源,發(fā)展獼猴桃酒,可以增加獼猴桃產(chǎn)業(yè)的附加值,推動獼猴桃產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展.但由于缺乏獼猴桃酒發(fā)酵專用酵母菌種,導(dǎo)致生產(chǎn)的獼猴桃酒香氣不足、果香不突出、典型性欠佳,嚴(yán)重影響了獼猴桃酒的質(zhì)量.應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù),構(gòu)建增香型獼猴桃酒酵母將對改善獼猴桃酒質(zhì)量起到關(guān)鍵作用.原生質(zhì)體融合技術(shù)作為一種最為有效的工業(yè)微生物育種手段之一,

2、能夠?qū)崿F(xiàn)基因的大量、高頻、多位點(diǎn)的重組和整合,適合用于增香酵母的構(gòu)建.該研究以一株發(fā)酵力強(qiáng)的酵母和一株產(chǎn)香性能好的酵母作為親株,通過單親滅活原生質(zhì)體融合技術(shù),構(gòu)建出增香型獼猴桃干酒酵母,用以增強(qiáng)獼猴桃酒香氣,較大程度改善獼猴桃酒品質(zhì).研究結(jié)果表明:1.通過對Y1、Y2、Y3、Y4等4株酵母的發(fā)酵力、發(fā)酵過程中糖度變化趨勢、原酒主要理化指標(biāo)和成品酒感官品評結(jié)果綜合分析,選取Y1和Y3適合作為融合親本.2.紫外線誘變方法制備Y1單倍體遺傳標(biāo)

3、記,得到一株組氨酸缺陷型突變株.3.親株原生質(zhì)體制備的適宜條件①菌齡:斜面菌種轉(zhuǎn)接于5ml YEPD液體培養(yǎng)基,振蕩培養(yǎng)12h,按1%接種量轉(zhuǎn)接于50ml YEPD液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)5h,菌濃度達(dá)10<'7>個/ml.②預(yù)處理:菌體10<'8>個,預(yù)處理液3ml,30℃恒溫水浴,振蕩處理15min.③酶解條件:菌體10<'8>個,蝸牛酶濃度20mg/ml,酶用量60mg,酶解溫度37℃恒溫水浴,間歇微振蕩.Y1(his<'->)酶解

4、45min,原生質(zhì)體形成率98.2%,再生率20.3%;Y3酶解60min,原生質(zhì)體形成率95.3%,再生率21.3%.4.Y3原生質(zhì)體滅活條件:80℃恒溫水浴處理30min,滅活率達(dá)100%.5.融合條件:兩親株原生質(zhì)體各10<'8>個,1:1比例混合,30℃恒溫水浴中預(yù)培養(yǎng)15min,促融劑2ml,30℃融合30min,融合率達(dá)10<'-5>.6.檢出的69株融合子經(jīng)初篩,得到10株發(fā)酵力強(qiáng)的融合子.進(jìn)一步的獼猴桃酒發(fā)酵試驗結(jié)果證明

5、,與親株相比,融合子F25和F41與Y1具有同樣強(qiáng)的發(fā)酵力:發(fā)酵的獼猴桃酒理化指標(biāo)和感官品評結(jié)果表明,融合子整合了親株的優(yōu)良性狀.7.GC-MS香氣成分分析結(jié)果表明,親株和融合株發(fā)酵酒的香氣成分在種類上和含量上均有差異.進(jìn)一步的主成分分析結(jié)果表明,各菌株香氣成分的差異主要在于2-丙酸丁酯、乙酸異戊酯、己酸、2-苯乙醇、琥珀酸單乙酯、4-羥基-苯乙醇、2-甲基琥珀酸二乙酯、3-羥基-4-甲氧基-苯甲酸、肉桂酸乙酯等10種成分的含量和配比.