花生RIL群體抗青枯病鑒定與抗病基因AhqBW3的克隆和功能鑒定.pdf

1、花生是我國(guó)重要的油用兼食用經(jīng)濟(jì)作物，在人民生活和國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占據(jù)重要地位。由青枯雷爾氏菌引起的青枯病是花生最重要的土傳性細(xì)菌病害，嚴(yán)重影響了花生的生產(chǎn)，目前沒(méi)有有效的化學(xué)防治手段，因此解決青枯病最有效的手段還是培育抗病品種。國(guó)內(nèi)外對(duì)花生抗青枯病的分子機(jī)理研究甚少，對(duì)控制青枯病的抗性基因數(shù)目、作用機(jī)制、花生-青枯菌互作的機(jī)理還不清楚，使培育抗青枯病高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種進(jìn)程緩慢。因此本研究通過(guò)篩選抗性種質(zhì)資源，分離和鑒定花生抗青枯候選基因，為研究其抗

2、青枯的分子機(jī)制，促進(jìn)花生抗青枯分子育種提供基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.實(shí)驗(yàn)室前期以高抗青枯病的花生品種粵油92和高感青枯病的花生品種新會(huì)小粒為親本，構(gòu)建了抗青枯重組自交系(Recombinant Inbred Lines,RIL)群體，本研究對(duì)F9代RIL群體的300個(gè)家系進(jìn)行了農(nóng)藝性狀考查，通過(guò)大田接種青枯菌進(jìn)行了抗青枯性狀鑒定。結(jié)果表明主莖高、側(cè)枝長(zhǎng)、總分枝數(shù)、單株果數(shù)、單株飽果數(shù)、單株果重等六個(gè)農(nóng)藝性狀觀察值呈連續(xù)分布

3、，屬于多基因控制的數(shù)量性狀遺傳。RIL群體對(duì)青枯菌的抗性表現(xiàn)差異顯著，且存在超親優(yōu)勢(shì)?；ㄉ嗫莶】剐詫儆跀?shù)量性狀，且與分枝數(shù)、單株果重等性狀間連鎖關(guān)系不緊密。根據(jù)病情指數(shù)進(jìn)行篩選，群體中抗青枯病的材料有58份，高感青枯病的材料有125份。通過(guò)比較篩選出了10個(gè)高抗青枯病的家系(16,108,130,131,251,261,336,362,475,646)和10個(gè)高感青枯病的家系(4,13,35,151,161,265,287,317,4

4、63,552)。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期抗黃曲霉抗性鑒定的結(jié)果，從中選出了3個(gè)兼抗青枯病和黃曲霉的家系(16,251,475)；其中2個(gè)家系(475,251)是單株產(chǎn)量(單株果重分別為38g，43g)，黃曲霉和青枯病抗性都比較高的綜合優(yōu)良材料，可作為優(yōu)異種質(zhì)進(jìn)行研究。
　　2. NBS-LRR類抗病基因是目前已知的在植物抗病防御反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的抗病基因最大家族。本研究在對(duì)花生抗青枯 QTL遺傳連鎖圖譜分析的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與抗青枯分子

5、標(biāo)記SNP79緊密連鎖的NBS-LRR類基因AhqBW3，該基因在抗病品種粵油92中受青枯菌誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)4倍，通過(guò) RACE獲得了其全長(zhǎng) cDNA，該基因全長(zhǎng)2,998bp，編碼855個(gè)氨基酸，具有典型的NBS-LRR類保守結(jié)構(gòu)域，在洋蔥表皮細(xì)胞瞬間表達(dá)其與GFP融合蛋白定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。熒光定量分析AhqBW3受青枯菌侵染后的表達(dá)模式顯示，在抗青枯花生品種粵油92中下調(diào)表達(dá)，在感病材料新會(huì)小粒中先上調(diào)表達(dá)后略下調(diào)表達(dá)。ABA、E

6、T、JA等激素誘導(dǎo)下，AhqBW3在抗青枯花生品種粵油92中下調(diào)表達(dá)，在感病材料新會(huì)小粒中上調(diào)表達(dá)。該基因在本氏煙草葉片瞬間超表達(dá)能引起過(guò)敏性反應(yīng)。超表達(dá)AhqBW3感青枯病煙草品種紅大對(duì)青枯菌的抗性明顯增強(qiáng)。深入研究AhqBW3超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草在接種青枯菌后一系列防御反應(yīng)相關(guān)基因NtH1N1，NtHSR515，NtPR1b，NtPR2，NtPR4，NtPR1ak，NtNPR1和NtAcs6發(fā)現(xiàn)，這些基因與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾榷寄軌蛎黠@