2014~2016年東營及鹽城地區(qū)野鳥與家禽中AIV監(jiān)測及其遺傳進化研究.pdf

1、禽流感全名鳥禽類流行性感冒。禽流感病毒（Avain Influenza Virus，AIV）屬于正粘病毒科流感病毒屬。AIV全基因組由8個負鏈的單鏈RAN組成，分別為PB2，PB1，PA，HA，NP，NA，M，和NS基因。目前已發(fā)現16種HA和9種NA，其互相組合形成了多種AIV亞型，如H9N2亞型、H5N1亞型。野鳥被認為是AIV的天然宿主，但野鳥攜帶的禽流感病毒一般不直接感染人。近期我國爆發(fā)的新型H7N9和H10N8禽流感疫情嚴重威

2、脅公共健康，并給我國的家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失(Chen et al.,2014)。研究表明，兩者均為低致病性AIV，其HA和NA的來源均與東亞-澳大利亞遷徙路線上的野鳥有關，而內部基因來自家禽中流行的H9N2亞型AIV。因此，對我國遷徙候鳥及其棲息地區(qū)家禽中AIV的監(jiān)測、對野鳥和家禽攜帶的AIV的遺傳多樣性、對不同棲息地間AIV傳播的時空特征的研究工作具有重要的意義。
　　本研究以入選國際重要濕地名錄的黃河三角洲（山東東營

3、）和江蘇鹽城濕地作為東亞-澳大利亞遷徙路徑上的北、南兩個研究基地，自2014年11月至2016年2月從兩研究基地共進行了6次采樣，其中東營和鹽城各采樣3次。共采集糞便、拭子等樣本6570份，其中家禽樣本3093份，野鳥樣本3477份。利用AIV通用型引物，TaqMan探針熒光定量PCR（Real-time PCR）方法檢測樣本中AIV陽性率。活禽市場家禽樣本中AIV陽性率為8.8％~35.0%（22/250~210/600），野鳥中 A

4、IV陽性率為0.3%~9.4%（2/688~78/826）。利用普通PCR方法對Real-time PCR測得Ct值<30的樣本進行H5亞型鑒定。將非H5亞型的樣本接種9~11日齡SPF雞胚進行病毒分離。H5亞型樣本送往國家疾控中心微生物所進行病毒分離。共分離到29株H9N2、13株H5N1、2株H3N2、2株H5N2和2株H5N1+H3N2的混合感染毒株。其中除3株H9N2分離自鹽城外，其他毒株均來自東營。除3株H9N2分離自東營地區(qū)

5、野鳥外，其他均分離自家禽。并利用二代測序測得所有毒株的50個全基因組序列。自東營的前兩次采樣中獲得25株AIV毒株。其中H9N2亞型占88%（22/25），H5N1亞型占4%（1/25）。而自東營的第三次采樣中獲得的22個AIV毒株中H9N2亞型占18.2%（4/22），H5N1亞型毒株占63.6%（14/22）。這一數據說明東營地區(qū)的主要流行亞型可能由H9N2轉變?yōu)镠5N1亞型。選取上述分離自東營的2株野鳥源、20株雞源和鹽城的3株雞

6、源株（共25株）H9N2亞型AIV全基因組，進行了分子特征、系統發(fā)育及溯源分析。自NCBI數據庫下載每個毒株對應的100條與其親緣關系最近的序列，用Muscle軟件將參考序列與本研究選取的序列對齊后，利用RAxML軟件構建基因進化樹。根據樹形與Bootstrap值對8個基因片段的進化樹進行了組別劃分，并根據這一劃分，最終將所述的25個AIV分為九個新的基因型。22個分離自東營的毒株在這九個基因型中均有分布，這表明東營地區(qū)的H9N2具有高

7、度的遺傳多樣性，說明它們可能經歷了頻繁的基因重配。此外，基因型6中的毒株內部基因除一個毒株的PB2基因外其他均與基因型1（由分離自東營的兩野鳥株組成）中的相同。這一證據可能暗示了病毒在野鳥與家禽之間的傳播。選取自東營某養(yǎng)鴨場分離到一株鴨源H5N1亞型 AIV，將該毒株命名為A/Duck/Shandong/1-14/2014(H5N1)，用以研究我國流行的H5N1高致病性AIV的進化與傳播。對病毒HA基因進行系統發(fā)育分析表明其屬于2.3.

8、2.1c家系。根據其他基因的系統發(fā)育進化樹發(fā)現，除了PB2基因來自于H9N2亞型外，其余7個基因均來自于H5N1。該毒株與北美首例人感染H5N1和造成2015年1月河南三門峽野鳥疫情的毒株屬于同一個基因型，為2.3.2.1c中一個新近報道的基因型。并且該基因型病毒于不同時間點在我國的北京、山東和河南等地的家禽和野鳥中出現，表明其已具備了一定的適應性并在持續(xù)傳播。尚未發(fā)現該基因型的毒株在關鍵氨基酸位點發(fā)生變異。本研究為2014年11月至2