甘藍(lán)型油菜隱性純合兩型系的形態(tài)學(xué)及轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)主要目的是為了研究甘藍(lán)型油菜隱性純合兩型系中雄性不育現(xiàn)象發(fā)生的分子機(jī)理。由于甘藍(lán)型油菜雄性不育的現(xiàn)象主要與多基因間的互做以及花粉發(fā)育等生物途徑直接相關(guān)。因此，本研究以遺傳背景極為相似的甘藍(lán)型油菜隱性純合兩用系WSLA和WSLB為材料，分別對(duì)不育系WSLA和可育系WSLB的形態(tài)學(xué)觀察和轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平兩方面進(jìn)行了綜合分析，以解釋材料中雄性不育的發(fā)生機(jī)制。細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面主要根據(jù)不同的染色劑，在不同時(shí)間，不同濃度對(duì)材料染色效果的影響等方面

2、進(jìn)行對(duì)比分析，找出一種比較適合觀察本材料的切片方法。然后再通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征判斷不育的時(shí)期以及花蕾的大小與不同發(fā)育時(shí)期的關(guān)系從而定位不育時(shí)期，進(jìn)而為進(jìn)一步提取RNA及轉(zhuǎn)錄組分析做充分準(zhǔn)備。同時(shí)也為材料切片的觀察做了詳細(xì)而明確的指導(dǎo)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)方面主要通過(guò)分析不育和可育的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)探究控制其不育的代謝途徑以及調(diào)控不育的相關(guān)基因。并以此為理論基礎(chǔ)為今后轉(zhuǎn)基因工程育種奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為后續(xù)基因功能分類提供了重要的參考資料。研究的主要

3、內(nèi)容如下:
　　(1) WSLA與WSLB的形態(tài)學(xué)分析:1）在試驗(yàn)過(guò)程中，分別對(duì)脫水試劑選擇及時(shí)間、切片厚度和染色劑的選擇等方面對(duì)條件進(jìn)行了優(yōu)化處理，結(jié)果表明:叔丁醇的脫水及透明效果優(yōu)于乙醇和丙酮，脫水最佳時(shí)間為30min;切片厚度為10微米時(shí)，組織發(fā)育的各個(gè)時(shí)期在顯微鏡下可以明顯辨別;在染色劑選擇上運(yùn)用甲苯胺藍(lán)-伊紅雙重染色方法的切片，其在顯微鏡校的圖像不但清晰而且明暗效果極佳，特別適合于形態(tài)學(xué)觀察。2）通過(guò)顯微結(jié)構(gòu)觀察分析發(fā)現(xiàn)

4、材料花蕾大小與花藥各個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的相互關(guān)系主要表現(xiàn)為:不育材料縱徑在1.1～1.6毫米時(shí)，花藥處于原基發(fā)育時(shí)期;當(dāng)縱徑在1.6～2.1毫米時(shí)，花粉囊中只有極少數(shù)花粉;當(dāng)花蕾縱徑在2.1～2.5毫米時(shí)，花粉囊無(wú)明顯分化跡象;當(dāng)花蕾縱徑在2.5～4.7毫米時(shí)，花藥中的花粉囊始終處于未能分化狀態(tài)。通過(guò)對(duì)切片結(jié)果和數(shù)據(jù)的分析比對(duì)發(fā)現(xiàn)，可以確定材料的雙重染色效果最明顯。發(fā)生不育的時(shí)期為小孢子四分體時(shí)期，且其所對(duì)應(yīng)的花蕾大小應(yīng)在1.6～2.1毫米

5、左右。
　　(2) WSLA與WSLB的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，通過(guò)材料的形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)具體的敗育時(shí)期為小孢子四分體時(shí)期。因此，我們對(duì)WSLA與WSLB四分體時(shí)期的花蕾進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果表明:測(cè)序得到的序列片段(reads)對(duì)甘藍(lán)型油菜基因組的覆蓋高達(dá)125倍，有超過(guò)97％的reads是高質(zhì)量的在基因組上特異匹配的reads。根據(jù)RNA-Seq的reads在甘藍(lán)型油菜的基因組及基因上的匹配，繪制了甘藍(lán)型油菜相關(guān)序列檢測(cè)以及表達(dá)的相關(guān)圖譜

6、。通過(guò)代表基因轉(zhuǎn)錄水平的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)RPKM處理之后，在此基礎(chǔ)上再對(duì)甘藍(lán)型油菜可育植株和不育植株基因的RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，一共發(fā)現(xiàn)2557個(gè)差異表達(dá)基因(p-value＜0.001)。不育材料中轉(zhuǎn)錄上調(diào)的有1542個(gè)，不育材料中轉(zhuǎn)錄下調(diào)的有1015個(gè)，其中花器官特異表達(dá)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AT5G52160上調(diào)非常明顯，銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因AT3G13400下調(diào)也是異常顯著，屬于擬南芥中的SKS基因家族。另外，與育性相關(guān)的

7、基因位點(diǎn)MS1和MS2在可育WSLB中均表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，但是表達(dá)量很少，說(shuō)明不育也可能與MS基因位點(diǎn)存在關(guān)聯(lián)性，AT3G51590與AT4G00040為脂肪酸代謝途徑的關(guān)鍵基因，在WSLA中均表現(xiàn)為明顯下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明小孢子的敗育可能是由于這兩個(gè)基因調(diào)控的絨氈層中脂肪酸代謝紊亂進(jìn)而導(dǎo)致孢粉素的合成受阻引起。GO基因注釋發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因中大部分是與轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、脂類及脂肪酸類代謝途徑相關(guān)，但在上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的基因中分別共存在488條和