甘藍型油菜隱性純合兩型系的形態(tài)學及轉(zhuǎn)錄組學分析.pdf

1、本實驗主要目的是為了研究甘藍型油菜隱性純合兩型系中雄性不育現(xiàn)象發(fā)生的分子機理。由于甘藍型油菜雄性不育的現(xiàn)象主要與多基因間的互做以及花粉發(fā)育等生物途徑直接相關。因此，本研究以遺傳背景極為相似的甘藍型油菜隱性純合兩用系WSLA和WSLB為材料，分別對不育系WSLA和可育系WSLB的形態(tài)學觀察和轉(zhuǎn)錄組表達水平兩方面進行了綜合分析，以解釋材料中雄性不育的發(fā)生機制。細胞形態(tài)學方面主要根據(jù)不同的染色劑，在不同時間，不同濃度對材料染色效果的影響等方面

2、進行對比分析，找出一種比較適合觀察本材料的切片方法。然后再通過細胞形態(tài)學特征判斷不育的時期以及花蕾的大小與不同發(fā)育時期的關系從而定位不育時期，進而為進一步提取RNA及轉(zhuǎn)錄組分析做充分準備。同時也為材料切片的觀察做了詳細而明確的指導。轉(zhuǎn)錄組學方面主要通過分析不育和可育的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來探究控制其不育的代謝途徑以及調(diào)控不育的相關基因。并以此為理論基礎為今后轉(zhuǎn)基因工程育種奠定堅實的理論基礎，同時也為后續(xù)基因功能分類提供了重要的參考資料。研究的主要

3、內(nèi)容如下:
　　(1) WSLA與WSLB的形態(tài)學分析:1）在試驗過程中，分別對脫水試劑選擇及時間、切片厚度和染色劑的選擇等方面對條件進行了優(yōu)化處理，結果表明:叔丁醇的脫水及透明效果優(yōu)于乙醇和丙酮，脫水最佳時間為30min;切片厚度為10微米時，組織發(fā)育的各個時期在顯微鏡下可以明顯辨別;在染色劑選擇上運用甲苯胺藍-伊紅雙重染色方法的切片，其在顯微鏡校的圖像不但清晰而且明暗效果極佳，特別適合于形態(tài)學觀察。2）通過顯微結構觀察分析發(fā)現(xiàn)

4、材料花蕾大小與花藥各個不同發(fā)育時期的相互關系主要表現(xiàn)為:不育材料縱徑在1.1～1.6毫米時，花藥處于原基發(fā)育時期;當縱徑在1.6～2.1毫米時，花粉囊中只有極少數(shù)花粉;當花蕾縱徑在2.1～2.5毫米時，花粉囊無明顯分化跡象;當花蕾縱徑在2.5～4.7毫米時，花藥中的花粉囊始終處于未能分化狀態(tài)。通過對切片結果和數(shù)據(jù)的分析比對發(fā)現(xiàn)，可以確定材料的雙重染色效果最明顯。發(fā)生不育的時期為小孢子四分體時期，且其所對應的花蕾大小應在1.6～2.1毫米

5、左右。
　　(2) WSLA與WSLB的轉(zhuǎn)錄組學分析，通過材料的形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)具體的敗育時期為小孢子四分體時期。因此，我們對WSLA與WSLB四分體時期的花蕾進行了轉(zhuǎn)錄組分析，結果表明:測序得到的序列片段(reads)對甘藍型油菜基因組的覆蓋高達125倍，有超過97％的reads是高質(zhì)量的在基因組上特異匹配的reads。根據(jù)RNA-Seq的reads在甘藍型油菜的基因組及基因上的匹配，繪制了甘藍型油菜相關序列檢測以及表達的相關圖譜

6、。通過代表基因轉(zhuǎn)錄水平的標準化數(shù)據(jù)RPKM處理之后，在此基礎上再對甘藍型油菜可育植株和不育植株基因的RNA-Seq數(shù)據(jù)進行差異表達分析，一共發(fā)現(xiàn)2557個差異表達基因(p-value＜0.001)。不育材料中轉(zhuǎn)錄上調(diào)的有1542個，不育材料中轉(zhuǎn)錄下調(diào)的有1015個，其中花器官特異表達的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白基因AT5G52160上調(diào)非常明顯，銅離子轉(zhuǎn)運蛋白相關基因AT3G13400下調(diào)也是異常顯著，屬于擬南芥中的SKS基因家族。另外，與育性相關的

7、基因位點MS1和MS2在可育WSLB中均表現(xiàn)為上調(diào)表達，但是表達量很少，說明不育也可能與MS基因位點存在關聯(lián)性，AT3G51590與AT4G00040為脂肪酸代謝途徑的關鍵基因，在WSLA中均表現(xiàn)為明顯下調(diào)表達，說明小孢子的敗育可能是由于這兩個基因調(diào)控的絨氈層中脂肪酸代謝紊亂進而導致孢粉素的合成受阻引起。GO基因注釋發(fā)現(xiàn)差異表達基因中大部分是與轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)運蛋白、脂類及脂肪酸類代謝途徑相關，但在上調(diào)和下調(diào)表達的基因中分別共存在488條和