毒力蛋白Apyrase和染色體編碼的亞復方物形成毒力復合物對細菌胞間擴散的影響.pdf

1、志賀氏菌（Shigella flexneri）5a M90T是一類具有高度傳染性和嚴重危害的革蘭氏陰性桿菌，是導致人類腹瀉的最為常見的病原菌。比較基因組學表明志賀氏菌可能是由非致病性大腸桿菌通過趨同進化而來，并且通過基因水平轉移獲得了一個毒力大質粒從而變成致病菌。志賀氏菌在致病過程中所需的大多數(shù)蛋白都是由毒力大質粒編碼的，包括膜蛋白復合物Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)。本課題要考察的是，在志賀氏菌的細胞膜上是否還有其它毒力相關膜蛋白復合物呢？

2、
　　為了回答這個問題，我們利用BN/SDS-PAGE比較志賀氏菌5aM90T野生株和毒力大質粒缺失株的膜蛋白復合物譜，發(fā)現(xiàn)了一個野生株特有的膜蛋白復合物，將之命名為M90T-290。然后通過SDS-PAGE分離和質譜鑒定M90T-290的蛋白組成，發(fā)現(xiàn)它是由大質粒編碼的Apyrase和染色體編碼的C1pB、DnaK、YdgA、EF-TU、GapA組成。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，其中兩個組成蛋白Apyrase和DnaK都與毒力蛋白VirG的極

3、性分布有關。推測膜蛋白復合物M90T-290是毒力相關的膜蛋白復合物。
　　本文通過提取復合物各亞基的缺失突變株天然結構的膜蛋白復合物，BN-PAGE分離膜蛋白復合物，觀察BN-PAGE條帶的變化，發(fā)現(xiàn)△ydgA、△phoN2、△dnaK較野生株缺少了M90T-T290，△c1pB并不影響M90T-290的形成。說明Apyrase、DnaK、YdgA是膜蛋白復合物M90T-290的必需組成成分，C1pB不是M90T-290組成成分

4、。為了進一步確定復合物各亞基的相互作用關系，利用Pull-down實驗分析，結果表明復合物各亞基間存在廣泛的兩兩相互作用。
　　然后考察了M90T-290是否影響細菌的毒力。通過HeLa細胞侵襲實驗和豚鼠角膜實驗發(fā)現(xiàn)，與野生株和相應的回復株相比，缺失了復合物M90T-290的突變株△ydgA、△phoN2、△dnaK的毒力明顯減弱，表明復合物M90T-290是福氏志賀氏菌5a M90T的發(fā)揮毒力功能所必需的。
　　復合物M9

5、0T-290是否通過影響VirG極性分布和宿主細胞中actin的聚集發(fā)揮毒力呢？為了回答這個問題，利用免疫熒光實驗分析了復合物各亞基缺失株對VirG極性分布和宿主細胞中aetin聚集的影響。結果顯示在△phoN2、△dnaK中VirG不能極性分布，而△ydgA中VirG仍以極性分布。這說明Apyrase和DnaK這兩個蛋白是VirG的極性分布所必需的,跟是否形成復合物沒有關系，即復合物M90T-290存在與否不影響VirG的極性分布。<

6、br>　　志賀氏菌缺失phoN2、dnaK和ydgA后，聚集actin的能力喪失，進而無法在胞內和胞間擴散。產生這種結果有兩種可能的機制:1、Apyrase、 DnaK和YdgA形成復合物影響aetin的聚集;2、其中某個蛋白影響了actin的聚集，另外兩個蛋白影響這個蛋白的表達調控。我們的實驗結果表明phoN2、dnaK和ydgA不存在表達調控關系，排除了第二種可能性，說明是Apyrase、 DnaK和YdgA形成復合物影響actin

7、的聚集。
　　最后，通過對志賀氏菌膜蛋白復合物圖譜的進一步分析和質譜鑒定，發(fā)現(xiàn)了一個由染色體編碼蛋白DnaK、YdgA、EF-TU和GapA形成的亞復合物，命名為M90T-260。這個亞復合物M90T-260的形成不依賴于毒力蛋白Apyrase，并且在體內和體外實驗都可以結合重組表達的Apyrase形成的全復合物M90T-290。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)了一個福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）5aM90T所特

8、有的膜蛋白復合物M90T-290，由毒力蛋白Apyrase結合染色體編碼的亞復合物形成，后者由DnaK、YdgA、EF-TU和GapA蛋白組成。該復合物的缺失會導致細菌毒力的降低。其發(fā)揮毒力的機制是與另一個毒力蛋白VirG協(xié)同影響actin的聚集，促進志賀氏菌在胞內和胞間擴散。本研究不但發(fā)現(xiàn)了志賀氏菌毒力相關的膜蛋白復合物，初步闡述毒力機制，而且作為首次發(fā)現(xiàn)的染色體與毒力大質粒編碼蛋白形成復合物協(xié)同發(fā)揮毒力功能的例子，為志賀氏菌染色體與