番茄土傳病害拮抗菌的篩選、鑒定及其防病機(jī)理初探.pdf

1、番茄原產(chǎn)于南美洲，有較好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。近年來(lái)，設(shè)施番茄種植面積不斷擴(kuò)大，高溫高濕的設(shè)施環(huán)境給各種病蟲害提供了有利的生長(zhǎng)、繁殖條件，設(shè)施蔬菜病害頻繁暴發(fā)，而土傳病害（青枯病、枯萎病等）是影響設(shè)施番茄生產(chǎn)的主要病害。而使農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量大幅度降低，帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本文從寧夏、江蘇和福建等地的連作番茄、辣椒、西瓜等作物的根際土壤中分離、篩選出對(duì)番茄青枯病和枯萎病均有防治效果的拮抗細(xì)菌，對(duì)拮抗菌株的盆栽防效和田間防效測(cè)定，檢測(cè)其產(chǎn)生的抑菌

2、物質(zhì)，對(duì)其進(jìn)行種屬鑒定;并將防效最好的枯草芽孢桿菌PTS-394進(jìn)行綠色熒光蛋白標(biāo)記，以研究其在番茄根際土壤中的定殖動(dòng)態(tài);同時(shí)也對(duì)PTS-394的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。主要結(jié)果如下:
　　(1)從寧夏銀川、江蘇沭陽(yáng)和福建廈門的番茄、辣椒、西瓜等作物根際土壤中，分離純化獲得367個(gè)細(xì)菌分離物。以番茄枯萎病菌和番茄青枯病菌為靶標(biāo)菌，從367株分離物中篩選出對(duì)兩種病菌皆具有很強(qiáng)拮抗作用的菌株22株。拮抗細(xì)菌抑菌物質(zhì)的研究結(jié)果表

3、明:22株拮抗細(xì)菌均能分泌蛋白酶;不能分泌幾丁質(zhì)酶;3株細(xì)菌能分泌纖維素酶;3株細(xì)菌能分泌嗜鐵素。盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:拮抗細(xì)菌PTS-394對(duì)番茄枯萎病和青枯病的防效最高，分別為77.40％和80.00％;菌株H-70、L-1和SJ-280對(duì)番茄枯萎病和青枯病的防效均大于60％。對(duì)這四株拮抗細(xì)菌進(jìn)行16srRNA種屬鑒定，均為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。
　　(2)選擇防效最好的菌株P(guān)TS-394，為研究其在番

4、茄根際土壤中的定殖規(guī)律，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建一標(biāo)記菌株，即將同時(shí)攜帶綠色熒光蛋白基因和氯霉素抗性基因的重組質(zhì)粒pGFP22以電擊轉(zhuǎn)入生防菌株P(guān)TS-394內(nèi)，于含氯霉素平板上培養(yǎng)后，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)光菌落，得到標(biāo)記菌株P(guān)TS-GFP。對(duì)標(biāo)記菌株進(jìn)行生長(zhǎng)速率和抑菌活性測(cè)定，測(cè)定結(jié)果表明，菌株進(jìn)行綠色熒光蛋白基因標(biāo)記對(duì)其生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響，且室內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，標(biāo)記菌株對(duì)病原菌的抑菌活性與野生菌株沒(méi)有明顯差異。采用灌根法接種標(biāo)記菌株，以稀釋分離法

5、和Real-TimePCR測(cè)定標(biāo)記菌株P(guān)TS-GFP在番茄根際土壤的定殖動(dòng)態(tài)。平皿稀釋法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PTS-GFP在灌根0-15d時(shí)呈下降趨勢(shì)，15d后下降速度稍緩，至30d時(shí)可保持相對(duì)穩(wěn)定，約為6.5×104cfu/g，且RT-PCR法測(cè)得的定殖動(dòng)態(tài)亦呈下降趨勢(shì)，此與稀釋分離法測(cè)得的結(jié)果一致。
　　(3)本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及Box-Behnken設(shè)計(jì)的響應(yīng)曲面法(responsesurfaceme

6、thodology，RSM)對(duì)影響生防菌株P(guān)TS-394發(fā)酵培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使PTS-394發(fā)酵菌含量和抑菌活性最大的成分關(guān)鍵因子的最優(yōu)配比為:玉米淀粉11.48g/L、黃豆粉13.35g/L、酵母膏0.60g/L。此時(shí)菌含量預(yù)測(cè)值為4.43×109cfu/mL，抑菌帶寬為6.20mm。以優(yōu)化的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，得到最優(yōu)培養(yǎng)條件組合為:培養(yǎng)溫度30.84℃、初始pH6.93和裝液量65.15mL/250mL時(shí)，