四倍體載培棉種高密度遺傳圖譜的加密及棉花紅析R1和茸毛T1基因的精細定位.pdf

1、棉花是世界性重要的經(jīng)濟作物之一，棉纖維的品質(zhì)和色彩可以大大提升其經(jīng)濟價值。高密度的遺傳圖譜是植物基因組研究的基礎?？捎行шU明基因組的結構特征，為重要性狀基因的精細定位和圖位克隆奠定基礎。棉花葉片密生茸毛和紅株性狀均由單顯性基因控制。葉片中茸毛的發(fā)育不僅與棉纖維發(fā)育有相似之處，而且多毛具有抗蟲特性。紅葉中決定色素形成的基因可有效用于培育天然彩棉的育種實踐中。精細定位這2個關鍵基因，獲得其候選相關基因，進而進行結構、表達及系統(tǒng)進化分析，不僅

2、可闡明其作用機理，而且可為棉花纖維品質(zhì)改良、抗蟲育種及天然彩棉的培育提供重要基因資源。本研究在前人構建海陸棉花種間遺傳圖譜的基礎上，進一步開發(fā)和利用棉花新標記，進行圖譜加密和染色體結構特征分析;利用加密的圖譜信息，完成棉花茸毛及紅株兩個質(zhì)量性狀基因T1和R1的染色體精細定位和其候選基因的初步分析;結合已釋放的不同棉種EST及基因組序列信息，進行棉花WRKY類家族基因的全基因發(fā)掘、鑒定、分類和表達初步分析。主要研究結果如下:
　　

3、 1、高密度海陸種間遺傳圖譜的構建及基因組結構分析
　　 本研究利用新開發(fā)的gSSR引物及網(wǎng)上公開釋放的部分CER、CGR、COT、DC、DPL、SHIN及HAU編號的引物，與已開發(fā)的SSR標記位點進行冗余篩選，獲得1431對非冗余引物，在作圖親本TM-1和Hai7124之間篩選多態(tài)性，進而完成圖譜的加密工作。新獲得的海陸栽培棉種種間遺傳圖譜包含3414個位點，總長為3677.6cM，標記間的平均距離為1.08cM，分布在26條

4、連鎖群上。
　　 該圖譜上包含941個重復位點，分別由425對引物在親本TM-1和Hai7124間擴增產(chǎn)生。這些重復位點主要來源于SSR、REMAP、SRAP、AFLP、RT和In-Del等5種標記類型。其中326對SSR引物產(chǎn)生693個重復位點，包括287對SSR引物產(chǎn)生2個位點;37對產(chǎn)生3個位點;2對產(chǎn)生4個位點。分析這些重復位點的染色體分布，除位于部分同源染色體上的重復位點外，一些重復位點位于同一染色體上，另一些重復位點

5、位于非同源的不同染色體上，表明在四倍體棉花進化進程中基因組染色體內(nèi)部及染色體間發(fā)生了復制和重排等結構變異。
　　 新構建的遺傳圖譜上含86個位點簇(≥5 loci/cM)，涉及617個位點。除Chr.1上未發(fā)現(xiàn)位點簇外，這86個位點簇分布在其余25個連鎖群上，分布密度不均勻。其中，31個位點簇分布在At亞組上，涉及到229個位點;55個位點簇分布于Dt亞組上，涉及到388個位點。同時也檢測到19個基因島(≥5 EST-SSR l

6、oci/cM)和1個反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子區(qū)(≥5 REMAP loci/cM)。
　　 300個位點在作圖群體中不符合孟德爾遺傳規(guī)律(P＜0.05)。在連鎖群上構成12個偏分離富集區(qū)，At亞組和Dt亞組各分布6個。這12個偏分離富集區(qū)分布在11條染色體上，其中在Chr.20上有兩個偏分離富集區(qū)。在偏分離富集區(qū)上位點的偏向保持著一致性，其中8個偏向于親本TM-1，4個偏向于雜合子。
　　 2、兩個質(zhì)量性狀基因的精細定位和候選基因篩

7、選
　　 以構建的高密度海陸種間遺傳圖譜為基礎，分別利用(Sub16×T586)F2群體和[(Hai7124×T586)×Hai7124] BC1群體，完成棉花兩個重要的質(zhì)量性狀基因—紅株R1和茸毛T1基因的精細定位。將紅株R1基因定位在第16染色體標記NAU4956和NAU6752之間，遺傳距離分別為2.91cM和0.49cM;將茸毛T1基因定位在第6染色體NAU5434與NAU1277之間，距最近標記 NAU5434的遺傳距

8、離為0.6cM。
　　 基于精細定位的結果和網(wǎng)上公開釋放的棉花D基因組雷蒙德氏棉種的基因組序列信息，根據(jù)目標基因附近的標記序列映射雷蒙德氏棉基因組序列，獲得目標基因所在的候選物理區(qū)域。利用Fgenesh程序?qū)蜻x的物理區(qū)域進行ORF預測及BLAST2Go的功能注釋及代謝特征分析，結合所克隆基因作用特征完成候選基因的確定及功能初步分析。針對色素合成代謝途徑特點，篩選了6個候選基因，分別命名為RG1-RG6;參考前人擬南芥表皮毛發(fā)育

9、研究結果，初步確定標記映射區(qū)域與棉花密生茸毛性狀相關的6個候選基因，分別命名為TG1-TG6。
　　 形態(tài)及掃描電鏡分析顯示，隨著葉齡發(fā)育，T586的葉片色素沉積越來越多。葉片茸毛的發(fā)育隨著葉齡發(fā)育逐漸變稀，但每一發(fā)育階段，T586的葉片茸毛均顯著高于Hai7124，在成熟葉片上，Hai7124僅葉脈及葉邊緣可見茸毛分布，而T586葉片密被茸毛。選擇T586和Hai7124不同葉齡的棉花葉片（葉芽、幼葉及成熟葉），進行候選基因的

10、表達分析。Q-PCR分析表明，在控制棉花紅株性狀的6個候選基因中，基因RG4在T586色素沉積最多的成熟葉中，其表達量顯著高于同時期Hai7124葉片中的表達量，而其他候選基因在兩個親本材料色素差異最明顯時期葉片中的表達量都沒有達到顯著水平。在控制茸毛性狀的6個候選基因中，基因TG5在T586葉片每一發(fā)育階段的表達量與Hai7124之間均存在顯著或極顯著差異。同時，隨著葉片的發(fā)育，在T586和Hai7124中表達水平也隨之降低，與葉片表

11、皮茸毛密度分布特征一致。其余候選基因的表達未發(fā)現(xiàn)規(guī)律性。綜合基因表達、表型變化及掃描電鏡分析結果，推測RG4和TG5是控制兩個質(zhì)量性狀紅株R1和茸毛T1的候選基因。根據(jù)BLAST2Go的功能注釋表明，RG4是一個編碼八氫番茄紅素合酶的基因;TG5為一個bHLH類型的轉(zhuǎn)錄因子。
　　 3、棉花WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族全基因組分析
　　 已有研究報道，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族參與植物的生長發(fā)育、衰老等進程，同時對各種生物脅迫和非生物

12、脅迫都有一定的響應。在擬南芥中，AtWRKY44參與了擬南芥表皮毛形成。為了闡明WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族在棉花重要性狀形成中的可能角色，我們開展了WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族棉花全基因組的發(fā)掘、鑒定、分類和表達初步研究。
　　 利用在NCBI上公開釋放的棉花EST序列，結合Pfam數(shù)據(jù)庫提供的WRKY轉(zhuǎn)錄因子種子文件的全部2450條種子序列，比對棉花總EST數(shù)據(jù)庫，最終得到535條WRKY類EST序列。以這535條EST序列作為探針，通過電

13、子克隆技術，獲得95個含有WRKY結構域的Contig，其中74個Contig中至少含有一個完整的WRKY結構域，暫命名為Contig1-Contig74。與擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的進化分析顯示，74個Contig屬于3個組及5個亞組，其中3個組—GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ，分別含有16、49和9個Contig。GroupⅡ的五個亞組—GroupⅡ a、GroupⅡ b、GroupⅡ c、GroupⅡd和GroupⅡ

14、e分別含有5、2、25、12和5個Contig。
　　 利用公布的雷蒙德氏棉全基因組序列草圖，進一步對雷蒙德氏棉全基因組進行了WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員的預測，共得到109個WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員。分子進化分析將該轉(zhuǎn)錄因子家族成員分為3大類，其中GroupⅠ有19個成員，GroupⅡ有78個成員，GroupⅢ有12個成員。進一步與來源于擬南芥的WRKY家族基因聚類結果分析，將GroupⅡ分成GroupⅡa、GroupⅡb、Gro

15、upⅡc、GroupⅡd和GroupⅡ e五個亞組，每個組成員分別有7個、15個、29個、15個和12個。通過序列比對，發(fā)現(xiàn)有5個成員在WRKYGQK的保守結構域上存在有WRKYGKK的變異，分別是Gr WRKY31、GrWRKY39、GrWRKY46、GrWRKY35和GrWRKY78，并且這5個成員都屬于GroupⅡ c亞組;在GroupⅡc中的GrWRKY8還存在WRKYGHK結構域變異。除了在WRKYGQK的保守結構域上存在變異

16、，在GroupⅠ N、GroupⅠ C和GroupⅢ中發(fā)現(xiàn)WRKY家族成員在鋅指結構上也存有一定的變異。
　　 通過序列相似性比對來自棉花EST數(shù)據(jù)庫和雷蒙德氏棉基因組的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，前期預測的74個Contig中，除屬于GroupⅡc亞組的Contig69、70、71和73等4個Contig外，70個Contig能在二倍體D基因組雷蒙德氏棉中找到高度相似的同源序列。推測4個未找到同源序列的Contig可能是四倍體棉種在進化

17、過程中獲得的新基因或是At亞組專有的WRKY轉(zhuǎn)錄因子。
　　 從陸地棉TM-1基因組中克隆獲得Gh WRKY19、GhWRKY23、GhWRKY60、GhWRKY87、GhWRKY95等5個成員全長ORF的基因組信息。其中，Gh WRKY19ORF全長為1401bp，編碼466個氨基酸，含有4個內(nèi)含子;GhWRKY23 ORF全長為942bp，編碼313個氨基酸，含有4個內(nèi)含子;GhWRKY60 ORF全長為1068bp，編碼3

18、55個氨基酸，含有2個內(nèi)含子;GhWRKY87 ORF全長為807bp，編碼268個氨基酸，含有2個內(nèi)含子;GhWRKY95 ORF全長為966bp，編碼321個氨基酸，含有2個內(nèi)含子。不同組織、器官表達特征表明，WRKY類基因在根莖葉等營養(yǎng)器官中的表達量普遍高于在棉纖維中的表達量。GhWRKY38在根中高表達;GhWRKY19、GhWRKY87和Gh WRKY43在葉中高表達;GhWRKY74在根和莖中高表達;而GhWRKY21和Gh

19、WRKY60在根和葉中高表達。在纖維發(fā)育進程中高表達的WRKY家族成員主要檢測到Gh WRKY19、Gh WRKY21和GhWRKY23，其高表達的時期集中在-3dpa-5dpa，沒有檢測到在纖維發(fā)育后期高表達的基因。
　　 以陸地棉抗逆品種晉棉19三葉期幼苗為試驗材料，進行水楊酸(2mM SA)、茉莉酸甲酯(100tM MeJA)、脫落酸(200μMABA)、赤霉素(500μM GA)、鹽(200mM NaCl)、干旱(20％