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文檔簡介
1、多倍體現(xiàn)象與機(jī)體的正常發(fā)育是不相容的,哺乳動物胚胎在正常發(fā)育過程中存在微弱幾率(小鼠大約為0.1%)的自發(fā)多倍體現(xiàn)象,通常會導(dǎo)致流產(chǎn)或胎兒脊柱、骨骼、面部畸形等發(fā)育缺陷。在生命科學(xué)研究中,四倍體胚胎可以作為研究機(jī)體發(fā)育的有力工具,例如,用它來研究早期胎兒發(fā)育過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞體積、數(shù)目以及分裂速率的機(jī)制,也可以用它來改變雙親基因組在子代中的分配比例;更為重要的用途是通過四倍體補(bǔ)償作用獲得完全由ES細(xì)胞發(fā)育而來的個(gè)體,ES小鼠的獲得對基因功能
2、的分析、疾病動物模型的建立有十分重要的意義。為充分估計(jì)四倍體補(bǔ)償作用,就必須對因遺傳背景引起的小鼠四倍體胚胎發(fā)育能力的不同進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)通過電融合法由多種遺傳背景的小鼠分別獲得了四倍體胚胎,并對其電融合效率、附植前和附植后發(fā)育能力、與ES細(xì)胞構(gòu)建嵌合胚的發(fā)育能力進(jìn)行了比較。 不同遺傳背景的小鼠四倍體胚胎的電融合效率存在顯著差異:在融合電壓為100V/mm,脈沖時(shí)程2×50μsec條件下遠(yuǎn)交系小鼠胚胎B6D2F2和B6C3D2F
3、2的融合率顯著高于近交系C57,ICR和BALB/c(P<0,05)。 四倍體胚胎在體外的發(fā)育情況也受其遺傳背景的影響:附植前發(fā)育階段,在桑椹胚發(fā)育率和囊胚發(fā)育率上(B6D2F1xB6D2F1)F2和(B6C3F1×xB6D2F1)F2品系的四倍體胚胎都顯著高于C57和BALB/c品系的四倍體胚胎(P<0.5),遠(yuǎn)交系和近交系遺傳背景的小鼠四倍體胚胎囊胚細(xì)胞數(shù)目相比具有顯著差異(P<0..5或P<0.01);附植后發(fā)育階段,不同
4、遺傳背景的小鼠四倍體胚胎著床率間不存在顯著差異(P>0.05),遠(yuǎn)交系的小鼠四倍體胚胎得到5只發(fā)育至13.5dpc(days post coitum,dpe:)的胎兒,近交系的4n小鼠胚胎無一發(fā)育至11.0dpc。 因?yàn)镋S細(xì)胞的多能性會受到多次傳代以及凍融的影響,因此需要在本實(shí)驗(yàn)室條件下建立起ES細(xì)胞穩(wěn)定的分離培養(yǎng)和鑒定體系。本實(shí)驗(yàn)以3-5代ICR小鼠胎兒成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層,利用高糖DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,同時(shí)添加15%的新
5、生犢牛。清、0.1mM的2-巰基乙醇、1%的非必需氨基酸、2mM的谷氨酰胺和青、鏈霉素各50IU/ml、LIF(白血病抑制因子)2000IU/ml。5%CO2、飽和濕度、37℃C培養(yǎng),培養(yǎng)于囊胚貼壁后第5-6天離散Outgrowth(內(nèi)細(xì)胞團(tuán)增殖體),分別由43枚C57BIJ6J×129/Sv囊胚、38 枚(C57BL,/6J×DBA/2)Fl×129/Sv囊胚、49枚(C57BL/6JxC3H/HeJ)F1×129/Sv囊胚和9l枚B
6、6C3F1xB6D2F1囊胚得到4株、3株、4株和3株ES細(xì)胞系。選擇一株具有高度雜合背景的B6C3F1xB6D2Fl ES細(xì)胞系進(jìn)行核型分析、畸胎瘤實(shí)驗(yàn)后與ICR品系2n胚胎構(gòu)建嵌合體并得到具有生殖系傳遞能力的嵌合體小鼠(通過毛色判斷),證明此細(xì)胞系具有生殖系嵌合能力。 利用同一株具有生殖系嵌合能力的雜合背景ES細(xì)胞與不同遺傳背景(ICRxlCR、C57xC57、BALB/cx BALB/c、(B6D2FIxB6D2FI)F2
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