多葉苜蓿懸浮培養(yǎng)系的建立及其影響因子和耐熱性的研究.pdf

1、多葉苜蓿(Multifoliolate Alfalfa)是一種品質(zhì)優(yōu)良的苜蓿種質(zhì)材料，隨著研究者對(duì)多葉苜蓿研究的不斷深入，其越來越多的生產(chǎn)利用價(jià)值被發(fā)現(xiàn)，比如多葉苜蓿營(yíng)養(yǎng)價(jià)值比三葉苜蓿更高、適口性更強(qiáng)等。本研究通過探索多葉苜蓿懸浮細(xì)胞系建立的最適條件及其影響因子的研究，試圖為快速高效的獲得多葉苜蓿植株，多葉苜蓿突變體植株的篩選以及更加全面的從細(xì)胞層面研究分析多葉苜蓿生長(zhǎng)發(fā)育、生長(zhǎng)特性和品質(zhì)、產(chǎn)量特性提供可能。
　　此外，在建立高效

2、的多葉苜蓿懸浮細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行多葉苜蓿懸浮細(xì)胞耐熱性的研究，探索高溫對(duì)多葉苜蓿懸浮培養(yǎng)的影響，這為研究多葉苜蓿細(xì)胞對(duì)熱脅迫的反應(yīng)和適應(yīng)性的生化機(jī)制提供了理論依據(jù)，也為篩選出適合江淮地區(qū)種植的耐熱性多葉苜蓿種質(zhì)提供了可能。
　　本實(shí)驗(yàn)以多葉苜蓿品種飛馬自交二代作為材料，以NAA濃度、6-BA濃度、KT濃度、2，4-D濃度（單位為mg·L-1）、愈傷組織接種量和愈傷組織繼代培養(yǎng)時(shí)間這6個(gè)主要影響因子作為實(shí)驗(yàn)因素，每個(gè)因素設(shè)置

3、6個(gè)實(shí)驗(yàn)水平。通過均勻設(shè)計(jì)找到建立多葉苜蓿懸浮細(xì)胞系最適的培養(yǎng)條件，并對(duì)不同實(shí)驗(yàn)處理下多葉苜蓿懸浮細(xì)胞系的形態(tài)指標(biāo)和生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行觀察和測(cè)定，包括多葉苜蓿懸浮細(xì)胞顏色、懸浮細(xì)胞鮮、干重，懸浮細(xì)胞相對(duì)生長(zhǎng)量，懸浮細(xì)胞活力，懸浮細(xì)胞密實(shí)體積和懸浮液pH值等。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.多葉苜蓿懸浮細(xì)胞系建立的最適條件為0.5 mg·L-1 NAA，2.0 mg·L-16-BA，0.2 mg·L-1KT、2.5 mgL-12，

4、4-D、接種0.6g愈傷組織和愈傷組織繼代培養(yǎng)時(shí)間為10d。在該條件下多葉苜蓿懸浮細(xì)胞的鮮、干重達(dá)到最大，PCV含量也較高。多葉苜蓿懸浮細(xì)胞系的pH變化范圍為5.34～6.73之間，總體表現(xiàn)前期逐漸下降，后期上升的狀態(tài)。不同處理的最適pH值不一樣，其中處理3懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的最適pH值為5.87或6.04，此時(shí)懸浮細(xì)胞鮮、干重和細(xì)胞活力均能達(dá)到較大值。
　　2.KT濃度、2，4-D濃度、愈傷組織接種量和愈傷組織繼代培養(yǎng)時(shí)間等因素的不斷

5、增加對(duì)多葉苜蓿懸浮細(xì)胞鮮重的增長(zhǎng)有抑制作用;隨著KT濃度和愈傷組織接種量的增加對(duì)多葉苜蓿懸浮細(xì)胞干重有抑制作用;KT濃度和2，4-D濃度的增加會(huì)對(duì)多葉苜蓿懸浮細(xì)胞PCV值的升高起抑制作用;而6-BA濃度和愈傷組織接種量的不斷增大會(huì)對(duì)多葉苜蓿懸浮細(xì)胞PCV值有促進(jìn)作用;隨著6-BA濃度、2，4-D濃度和愈傷組織繼代培養(yǎng)時(shí)間的增大會(huì)對(duì)多葉苜蓿懸浮細(xì)胞干重的增加有促進(jìn)作用。
　　3.用TTC法測(cè)定多葉苜蓿懸浮細(xì)胞吸光值時(shí)應(yīng)在618nm波

6、長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定，采用磷酸鈉緩沖液，濃度0.6％ TTC溶液。不同處理?xiàng)l件下懸浮細(xì)胞活力表現(xiàn)出兩種不同的變化趨勢(shì)，一種為類似拋物線的先增加到最大然后逐漸降低，另一種為先減小后增大的趨勢(shì)。其中處理3條件下的懸浮細(xì)胞活力變化情況屬于前者。
　　4.通過觀察培養(yǎng)周期為14d的多葉苜蓿懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)過程，可知懸浮細(xì)胞液顏色從清澈變渾濁再變?yōu)楹贮S色，氣味也從無味變?yōu)橛挟愇?，懸浮?xì)胞生長(zhǎng)量從少到多，最后有大量細(xì)胞團(tuán)沉淀。繪制干濕生長(zhǎng)曲線可發(fā)現(xiàn)多葉苜

7、蓿懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的2d～6d為延滯期、6d～10d為指數(shù)增長(zhǎng)期，10d之后進(jìn)入衰退。處理3在懸浮細(xì)胞繼代培養(yǎng)的5d～12d細(xì)胞處于旺盛生長(zhǎng)階段，此時(shí)適合進(jìn)行多葉苜蓿原生質(zhì)體培養(yǎng)和繼代篩選工作。所有實(shí)驗(yàn)處理中處理3出愈率最高為59％，愈傷組織鮮重也較高，分化率為58％。多葉苜蓿懸浮細(xì)胞形成愈傷組織過程中污染率較高，超過50％均被污染。
　　5.高溫能在一定程度上促進(jìn)多葉苜蓿懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，這可能與高溫能促進(jìn)懸浮細(xì)胞的分裂有關(guān)。高溫

8、與多葉苜蓿懸浮細(xì)胞的褐化密切相關(guān)，隨著溫度的升高，懸浮細(xì)胞的褐化率也呈上升趨勢(shì)。其中在本實(shí)驗(yàn)條件下認(rèn)為35℃為高溫脅迫多葉苜蓿懸浮細(xì)胞系生長(zhǎng)的拐點(diǎn)溫度，40℃為多葉苜蓿懸浮細(xì)胞系的半致死溫度，45℃高溫時(shí)，懸浮細(xì)胞重度褐化，死亡現(xiàn)象表現(xiàn)嚴(yán)重。高溫會(huì)促使多葉苜蓿懸浮細(xì)胞脯氨酸含量的增加，這是由于當(dāng)高溫破壞多葉苜蓿細(xì)胞細(xì)胞膜透性和活性氧增多時(shí)，多葉苜蓿自身的保護(hù)機(jī)制起作用導(dǎo)致的。在高溫下，脯氨酸含量峰值比常溫下高，而且提前出現(xiàn)，即在高溫培養(yǎng)