甜菜夜蛾RNAi害蟲控制的潛在靶標基因篩選和風險評估.pdf

1、甜菜夜蛾（SpodopteraexiguaHubner），是一種危害嚴重的世界性害蟲。研究表明，通過dsRNAs或siRNAs沉默害蟲的重要基因是一種可行的害蟲防治方法，RNAi介導的害蟲控制的第一步是篩選出合適的靶標基因。為了研究RNAi技術在甜菜夜蛾控制中的應用，本論文首先根據(jù)基因在細胞代謝過程中的重要性，從甜菜夜蛾轉錄組數(shù)據(jù)中篩選出9個基因，研究了這些基因被干擾后對甜菜夜蛾的致死效果，同時開展了脫靶效應檢測和安全性評估，為安全有效

2、地利用RNAi技術進行甜菜夜蛾防治提供了依據(jù)。
　　1.甜菜夜蛾RNAi害蟲控制的潛在靶標基因全長克隆
　　根據(jù)玉米根葉甲中已知的害蟲控制靶標基因和基因在細胞代謝過程中的重要性，從甜菜夜蛾轉錄組數(shù)據(jù)中，篩選出9條甜菜夜蛾RNAi害蟲控制靶標基因，分別為ADP-ribosylationfactor1(arf1),ADP-ribosylationfactor2(arf2),tubulin1,tubulin2,chitinase1

3、,chitinase7,plasmaglutamatecarboxypeptidase(PGCP),helicase和ATPase基因。利用RACE技術，成功克隆得到6個基因(arf1，arf2，tubulin2，chitinase7，PGCP，helicase)的5'UTR，但只克隆得到arf2基因的3'UTR。將5'UTR、3'UTR序列與轉錄本序列進行拼接，其中5個基因(arf1，arf2，tubulin2，chitinase7，

4、helicase)有完整的CDS區(qū)，arf2基因得到全長。9條基因與其他昆蟲物種的同源基因具有很高的相似性，并已將9條基因序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫。
　　2.甜菜夜蛾RNAi害蟲控制的潛在靶標基因RNA干擾
　　根據(jù)9條基因的序列，設計siRNA，將2μlsiRNA（2μg/μl）注射到4齡幼蟲體內進行RNA干擾，利用qRT-PCR檢測RNAi的效率。結果顯示，與對照相比，靶標基因的mRNA豐度均有不同程度的下降(～20％-

5、94.3％)。同時8個基因(chitinase7，PGCP，chitinase1，ATPase，tubulin1，arf2，tubulin2和arf1)在被干擾后，死亡率顯著升高，其中PGCP-siRNA，chitinase1-siRNA，tubulin1-siRNA，tubulin2-siRNA和helicase-siRNA實驗組中約80％的存活個體出現(xiàn)發(fā)育遲緩，chitinase1-siRNA和chitinase7-siRNA實驗組

6、中12.5％的存活個體出現(xiàn)半蛻皮現(xiàn)象，arf1-siRNA和arf2-siRNA實驗組中15％的存活個體在注射siRNA48h后出現(xiàn)體色變黑的現(xiàn)象。
　　3.甜菜夜蛾RNAi脫靶分析
　　根據(jù)甜菜夜蛾RNAi實驗，選取chitinase1和arf2基因分別進行了RNAi脫靶效應分析。在分別沉默chitinase1和arf2基因后，對其進行DGE(DigitalGeneExpressionProfiling)分析和qRT-PC

7、R檢測。主要檢測了三類非靶標基因，第一類是與chitinase1和arf2基因的siRNA有不同連續(xù)匹配的非靶標基因，第二類是與chitinase1、arf2基因同源的非靶標基因，第三類是chitinase1、arf2基因所涉及的代謝通路中的其它基因，結果顯示這三類非靶標基因的表達量均有小部分發(fā)生顯著性上調或下調，第一和第二類可能是由于脫靶效應引起的，但第三類可能是代謝通路中的目標基因被干擾后的連鎖反應。
　　4.甜菜夜蛾siRN