生物學畢業(yè)論文

1、<p><b>　　引言</b></p><p>　　隱孢子蟲（Cryptosporidium）是細胞內寄生原蟲，能感染人與多種動物的消化道和呼吸道而引起隱孢子蟲?。–ryptosporidiosis)[1]。自從Tyzzer[2]在小鼠粘膜組織中發(fā)現(xiàn)小鼠隱孢子蟲(C. muris)以來，隱孢子蟲已經(jīng)被認為是世界脊椎動物中的一種廣泛傳播的重要寄生蟲，包括中國在內，隱孢子蟲已經(jīng)在世界

2、上六個大洲90個國家發(fā)現(xiàn)[3,4,5]，并經(jīng)常在嬰兒和兒童中發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)今被公認的隱孢子蟲有14種，其傳播途徑以卵囊經(jīng)糞-口途徑為主[6,7]。與其它介水傳播性原蟲相比，隱孢子蟲因粒徑小于10 µm和自身對消毒藥的較強抵抗力而被凈水工藝除去的難度更大，即使在濾過水中，卵囊的檢出率在英國和美國分別達到37%和26%，因此，隱孢子蟲污染已經(jīng)成為水源監(jiān)測的重要指標[6,8]。如今，隱孢子蟲能感染包括人在內的240多種動物，其中包括野禽、

3、兩棲動物等許多野生動物，是現(xiàn)今引起動物腹瀉的主要病原之一，嚴重威脅著人和動物的健康，造成了巨大的經(jīng)濟損失。</p><p>　　麋鹿屬于國家一級保護動物，是中國特有的動物，也是世界珍稀動物，曾經(jīng)是國際自然保護聯(lián)盟IUCN(World Conservation Union）紅皮書規(guī)定的極危物種。目前，雖然世界的麋鹿總數(shù)已經(jīng)繁殖達4000頭，但仍然是瀕危物種。近幾年來,隱孢子蟲屢次在野生和人工飼養(yǎng)的多種鹿類中發(fā)現(xiàn)，嚴

4、重威脅著鹿的健康，而至今未見關于麋鹿隱孢子蟲病的調查。因此，積極開展麋鹿隱孢子蟲病的流行病學調查，對其防治有著重要的意義。</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p>　　1.1 樣品采集與保存</p><p>　　從2010年到2011年，應用一次性手套，采集北京與大豐麋鹿自然保護區(qū)自然環(huán)境中新鮮的麋鹿糞便，編號，置于

5、冰壺，并同時記錄糞便的顏色與性狀。其中，北京采集樣品23個，大豐87個。樣品處理前，4℃低溫保存。</p><p><b>　　1.2 試劑</b></p><p>　　改良抗酸染色液：甲液(石炭酸復紅4 g，95 %乙醇20 ml，苯酚8 g，雙蒸水100 ml)，乙液(純硫酸10 ml,蒸餾水90 ml)，丙液(0.2 g孔雀綠，蒸餾水100 ml)。飽和鹽水(1

6、000 ml水加熱至沸騰加氯化鈉至不溶為止)。</p><p>　　胎牛血清、甲醇、蒸餾水。</p><p><b>　　1.3 試驗材料</b></p><p>　　載玻片、蓋玻片、20 ml試管數(shù)只、試管架、酒精燈、鑷子、一次性手套、口罩、錐形瓶、燒杯、EP管(0.5 ml、0.2 ml、7 ml、10 ml )、移液器、槍頭、記號筆、過濾

7、紗布、漏斗、玻璃棒、標簽紙等。</p><p>　　1.4 試驗儀器及設備</p><p>　　光學顯微鏡(OLYMPUS-XDS-1B)、數(shù)碼相機(OLYMPUS)、通風櫥(蘇凈集團安泰公司制造)、可調萬用電爐(龍口市電路制造廠)、電子天平(上海精天電子儀器有限公司)、離心機(湖南星科科學儀器有限公司)</p><p><b>　　1.5 試驗方法<

8、;/b></p><p>　　通過飽和鹽水漂浮法和改良抗酸染色法來對麋鹿隱孢子蟲卵囊進行檢查。具體操作步驟如下所述。</p><p>　　1.5.1 飽和鹽水漂浮法</p><p>　　按編號取麋鹿糞樣3 g于20 ml試管中，將試管依次編號，加入已經(jīng)配制好的飽和鹽水，用玻璃棒充分攪拌，靜置15~30 min后，過濾至已編號的待用試管中。將濾液5 ml一一對應

9、倒入已編號的10 ml EP管中，加水適量，放入離心機，3000 r/ min，離心10 min。取出棄掉上清液，用移液器取5 ml蒸餾水加入與管內離心剩余物充分混勻，重復以上離心步驟。取出后棄去上清液，用移液器取200 μl蒸餾水與離心產(chǎn)物混勻，取出放入500 μl EP管中置于4℃冰箱中保留備樣。</p><p>　　用移液器取2 μl牛血血清與載玻片上，按編號依次取20μl漂浮液與之混合，蓋上蓋玻片，40倍

10、物鏡鏡檢。</p><p>　　1.5.2 改良抗酸染色法 </p><p>　　按編號取麋鹿糞樣3 g于20 ml試管中，將試管依次編號，加入已經(jīng)配制好的飽和鹽水，用玻璃棒充分攪拌，靜置15~30 min后,過濾至已編號的待用試管中。之后，將過濾液5 ml一一對應倒入已編號的10 ml EP中，加水適量，放入離心機離心，要求轉速3000 r/ min,離心10 min后，取出棄掉上清液，

11、用移液器取5 ml蒸餾水加入與管內離心剩余物充分混勻，之后再重復以上離心步驟。取出后棄去上清液，用移液器取200 μl蒸餾水與離心產(chǎn)物混勻，之后取出放入500 μl EP管中置于4℃冰箱中保留備樣。</p><p>　　用移液器取2 μl牛血血清與載玻片上，按編號依次取20 μl漂浮液與之混合，涂成直徑約為1 cm大小的圓，用標簽紙將載玻片編號，待其自然干燥后，用酒精燈進行固定，之后進行染色。先用甲液染色5 mi

12、n，水洗，再滴加乙液，脫色2~5 min，水洗之后，再滴加丙液30 s，之后水洗晾干即可鏡檢。</p><p><b>　　1.6 檢測指標</b></p><p>　　1.6.1麋鹿隱孢子蟲的感染強度 </p><p>　　隱孢子蟲感染強度的判定主要是根據(jù)有關文獻資料的判定標準,并做相應的改進。用40倍物鏡觀察每個糞樣的3張涂片，發(fā)現(xiàn)卵囊即為

13、陽性。1-5 個卵囊表示為“+”， 6-10 個卵囊為“++”， 11-15個卵囊為“+++”，16-20個卵囊為“++++”，>20卵囊為“+++++”。未發(fā)現(xiàn)卵囊者為陰性“-”。</p><p>　　1.6.2蟲種的形態(tài)學觀察 </p><p>　　隨機選擇6個分離株分離純化的卵囊，在光學顯微鏡下，分別測量10個卵囊的長、短徑，計算卵囊指數(shù)，將卵囊指數(shù)和所測長短徑值，并觀察隱孢子

14、蟲卵囊的染色特征和直接鏡檢時的內部形態(tài)特征進行鑒定。</p><p><b>　　1.7 統(tǒng)計分析</b></p><p>　　試驗結果統(tǒng)計分析采用SPSS 12.0和Microsoft Office Excel 2003軟件，陽性率和發(fā)生率的比較采用χ2檢驗(α=0.05)。</p><p><b>　　2 結果與分析</b&

15、gt;</p><p>　　2.1麋鹿隱孢子蟲卵囊形態(tài)學</p><p>　　卵囊在40倍光學顯微鏡下觀察，可見卵囊呈圓形、扁圓形或橢圓形，卵囊最外層有一薄的卵囊壁，卵囊內部結構有呈月牙形的子孢子，圓點狀的殘留體 (圖1)。經(jīng)MAFS染色的卵囊呈圓形、扁圓形或橢圓形，外有一層透明的卵囊壁，在黃綠色或藍綠色背景下，卵囊呈粉紅色到鮮艷的玫瑰紅色 (圖2)。</p><p&g

16、t;　　圖1 圖2</p><p>　　圖1 40倍普通光學顯微鏡下，飽和鹽水漂浮法分離純化的麋鹿隱孢子蟲卵囊，米粒樣大小。</p><p>　　圖2 在40倍普通光學顯微鏡下，經(jīng)MAFS染色的麋鹿糞樣的隱孢子蟲卵囊，在藍綠色背景下呈粉紅色至鮮艷的玫瑰紅色。</p><p>　　2.2麋鹿隱孢子蟲卵的大小

17、</p><p>　　在100倍物鏡下，隱孢子蟲卵囊長徑在4.78μm-4.94μm之間，短徑在4.08μm-4.37μm之間，卵囊指數(shù)在1.12 到1.18之間。</p><p>　　2.3 麋鹿隱孢子蟲感染</p><p>　　圖3 不同季節(jié)麋鹿隱孢子蟲的感染率</p><p>　　2.3.1 感染率和感染強度</p>&l

18、t;p>　　在采集的110份麋鹿糞樣中，12份檢測到隱孢子蟲卵囊，總陽性率為10.90%。在所有的12份陽性樣品中，感染強度“+”和“++”的有10個和2個，分別占了總感染率的83.33 %和16.67%。北京地區(qū)檢出的陽性率為8.70%（2/23），大豐地區(qū)檢出的陽性率為11.49%（10/87），感染率之間差異不顯著(χ2=0.13，P>0.05)。</p><p>　　2.3.2感染的季節(jié)性&l

19、t;/p><p>　　從春季到冬季，麋鹿隱孢子蟲的感染率分別為6.25%(1/16)、12.00%(3/25)、17.39%(4/23)和8.70%(4/46)，如圖3所示。各季節(jié)感染率之間差異不顯著(χ2=0.0-1.99，P>0.05)。</p><p><b>　　3結論與討論</b></p><p>　　3.1 麋鹿隱孢子蟲病的檢測方

20、法的可行性</p><p>　　3.1.1 飽和鹽水漂浮法</p><p>　　本法為寄生蟲病實驗室檢查的常規(guī)方法之一，本文在常規(guī)飽和鹽水漂浮法的基礎上，取上清液于離心機中進行兩次離心，使糞便中蟲卵囊充分沉淀，保證足夠的卵囊數(shù)量，便于鏡檢和提高隱孢子蟲卵囊檢出率。 </p><p>　　3.1.2 改良抗酸染色法 </p><p>　　抗酸染

21、色原理已經(jīng)研究得較為透徹，一般認為抗酸性菌體或蟲卵內含脂類物質較多(含量可高達40% ) ，此物質具抗酸的性質。染色時，它與石炭酸復紅結合牢固,能抵抗酸性酒精的脫色作用，同時脂類又不易過細胞膜,不能被脫色，因此抗酸菌能保持復紅的顏色。相反,非抗酸性菌體內含脂類少，易被酸酒精脫色 ，脫色時又易從細胞膜滲出而脫掉,最后被復染成藍綠色。隱孢子蟲卵囊內的脂類含量較高，其中孢子化小球隱孢子蟲卵囊大約含有1.2×10-9 μmol磷脂，卵

22、磷脂占66%，對抗酸染色法具有特異性和敏感性。經(jīng)抗酸染色、脫色等步驟后，卵囊被染成玫瑰紅色，隱孢子蟲卵囊被染成紫紅色或玫瑰紅色，背景為藍綠色。卵囊圓形或橢圓形，直經(jīng)2~3 μm。仔細觀察，有的卵囊可見到子孢子，該染色法較為常用，效果尚好。但由于染色和脫色時間不同，卵囊著色結果不完全一致，有些卵囊著色深，結構清晰，有些卵囊染色淡，結構模糊，如果被檢驗的材料保存時間較長，2~3 d以后，則卵壁染色不均，卵囊像半月形，細胞僅部分著色。涂片在硫

23、酸里不充分脫色時，菌叢、酵母和真菌也可能染成玫瑰紅色，但它們內無結構，可根據(jù)它們的形態(tài)和大小與隱抱子蟲卵囊相區(qū)別。通常情況下</p><p>　　3.1.3 兩種方法結合的優(yōu)點</p><p>　　在本文對麋鹿隱孢子蟲病檢測的研究中，將飽和鹽水漂浮法和抗酸染色法兩種方法結合起來，方法確實，便于鏡檢和提高隱孢子蟲卵囊的檢出率。能夠發(fā)現(xiàn)和區(qū)分隱孢子蟲卵囊在兩種狀態(tài)下的形態(tài)結構，提高了試驗的檢出

24、效率。</p><p>　　3.2 麋鹿隱孢子蟲感染 </p><p>　　3.2.1 麋鹿隱孢子蟲感染的地域性</p><p>　　本研究發(fā)現(xiàn)，在采集的110份麋鹿糞樣中，12份檢測到麋鹿隱孢子蟲卵囊，其中北京地區(qū)檢出的陽性率低于大豐地區(qū)檢出的陽性率，二者之間差異不顯著。說明，麋鹿隱孢子蟲感染無地域性。</p><p>　　3.2.2 麋鹿

25、隱孢子蟲感染率與季節(jié)的關系</p><p>　　Yu等(2004)報道認為隱孢子蟲感染率夏季（22.1%）高于冬季（12.7%）[9]，Chai等[10]除報到春天明顯高于夏季和冬季，而且此季節(jié)性與溫度不相關，而與降雨量存在一定的相關性；而Sanford等報道沒有發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲感染的季節(jié)性[11]。與這些報道不同的是，本試驗中發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲感染率秋季最高，春季最低，各季節(jié)感染率之間差異不顯著。因此，感染無季節(jié)性。&l

26、t;/p><p>　　3.2.3 麋鹿隱孢子蟲的感染強度</p><p>　　本研究發(fā)現(xiàn)，在采集的110份麋鹿糞樣中，12份檢測到隱孢子蟲卵囊，總陽性率為10.90%。在所有的12份陽性樣品中，感染強度主要是低強度感染。由此提示，麋鹿感染隱孢子蟲病廣泛存在，但是大多數(shù)的感染強度是較低的。</p><p><b>　　4 小結</b></p&g

27、t;<p>　　本文應用改良抗酸染色法對大豐地區(qū)和北京地區(qū)麋鹿隱孢子蟲病流行病學情況進行調查發(fā)現(xiàn)，大豐地區(qū)和北京地區(qū)存在麋鹿隱孢子蟲病的感染率較高，但是大多數(shù)感染強度較低，發(fā)生無季節(jié)性和地域性。</p><p><b>　　致謝</b></p><p>　　兩年的本科學習生涯馬上就要畫上句號了，畢業(yè)前所有的努力與付出都凝聚在這篇論文里面。相信它雖然算不上

28、上乘之作，但的確是我用心血澆灌的答卷。</p><p>　　本文是在指導老師xx老師的悉心指導下完成的。從試驗的選題、設計到論文的撰寫無不凝聚著老師的心血，在此過程中，xx老師始終給予精心的指導和無微不至的關懷。xx老師熱情隨和、治學嚴謹、見識廣、胸懷寬廣，他淵博的學識、嚴謹?shù)闹螌W態(tài)度、開闊的科研思路使我受益終生，在此謹向xx老師表示衷心的感謝！</p><p>　　本篇畢業(yè)論文的寫作也得

29、到了青島農(nóng)業(yè)大學臨床獸醫(yī)專業(yè)各位師兄師姐的熱情幫助。感謝在整個畢業(yè)設計期間和我密切合作的同學，和曾經(jīng)在各個方面給予過我?guī)椭幕锇閭儯诖?，我再一次真誠地向幫助過我的老師和同學表示感謝！</p><p>　　同時，也感謝xx臨床獸醫(yī)實驗室為我提供良好的做畢業(yè)設計的環(huán)境。 </p><p>　　最后，再一次感謝所有在畢業(yè)設計中曾經(jīng)幫助過我的良師益友和同學，以及在設計中被我引用或參考的論著的作者

30、。</p><p><b>　　參考文獻：</b></p><p>　　[1] Widmer G, Feng X, Tanriverdi S. Genotyping of Cryptosporidium parvum with microsatellite markers. Methods Mol Biol , 2004, 268:177-87</p>

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