sod的制備課程設(shè)計1

1、<p>　　題 目：SOD的制備</p><p><b>　　姓 名: </b></p><p><b>　　學(xué) 號： </b></p><p>　　學(xué) 院：生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院</p><p>　　專 業(yè)：生物技術(shù)</p><p>　

2、　年 級：2010級</p><p><b>　　班 級： </b></p><p><b>　　指導(dǎo)老師： </b></p><p>　　時 間：2013年5月4日</p><p><b>　　目錄</b></p><p><b

3、>　　一 概述2</b></p><p>　　1、課程設(shè)計的目的2</p><p>　　2、課程設(shè)計的要求2</p><p><b>　　二 內(nèi)容2</b></p><p>　　1、自由基和SOD2</p><p>　　2、SOD的研究進(jìn)展5</p>&

4、lt;p>　　3、SOD的研究展望6</p><p>　　4、SOD檢測方法的確定6</p><p><b>　　5、器材與試劑7</b></p><p>　　6、SOD粗酶制品的獲取7</p><p>　　7、SOD粗酶品的精制7</p><p>　　8、SOD的鑒定8<

5、/p><p><b>　　11、附錄9</b></p><p><b>　　三 參考文獻(xiàn)10</b></p><p><b>　　一 概述</b></p><p><b>　　課程設(shè)計的目的</b></p><p>　　課程設(shè)計的目

6、的在于發(fā)展學(xué)生的科學(xué)探究能力、提高學(xué)生的科學(xué)素養(yǎng)。</p><p>　　2、 課程設(shè)計的要求</p><p>　　設(shè)計的內(nèi)容必須包括：調(diào)查該酶的基本性質(zhì)、應(yīng)用情況；檢測方法的確定；</p><p>　　粗酶制品的獲得；酶粗品的精制；酶的鑒定。</p><p><b>　　二 內(nèi)容</b></p><p

7、>　　1、 自由基和SOD</p><p>　　1.1 自由基的概念</p><p>　　氧自由基(Reactive Oxygen species,ROS)或稱活性氧，主要包括超氧陰離子自由基、羥自由，以及有機(jī)過氧化物自由基等。生命體在正常代謝過程中產(chǎn)生ROS， 而一些外界環(huán)境因素能增加細(xì)胞中ROS的濃度,若不能及時清除以恢復(fù)平衡， 會引起生物膜的過氧化損傷， 甚至造成細(xì)胞器的損害和

8、DNA與蛋白質(zhì)等的降解與失活。</p><p>　　1.2 SOD的基本性質(zhì)</p><p>　　1.2.1 SOD的研究簡述</p><p>　　生物體內(nèi)低濃度超氧陰離子自由基( O- 2 ) 是維持生命活動所必需的, 其濃度過高時, 可引起機(jī)體組織細(xì)胞氧化損傷, 導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生疾病, 甚至死亡。超氧化物歧化酶( Superox ide dismutase, 簡稱S

9、OD) 是清除生物體內(nèi)超氧陰離子自由基的一種重要抗氧化酶, 具有抗衰老、抗癌、防白內(nèi)障等作用[1], 因而受到全世界學(xué)術(shù)界廣泛關(guān)注, 使之成為涉及分子生物學(xué)、微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域及醫(yī)藥、化工、食品等生產(chǎn)行業(yè)的一個熱門研究課題[2]。</p><p>　　1.2.2 SOD的概念</p><p>　　超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)簡稱SOD，是一種生物活性蛋白

10、質(zhì)，是人體不可缺少、重要的氧自由清除劑，也是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一的以自由基為底物的酶。它廣泛存在于各類生物體內(nèi)[3]。</p><p>　　1.2.3 SOD的發(fā)現(xiàn)</p><p>　　1938 年, Mann和Keilin從牛紅細(xì)胞中分離提取出一種含Cu的血銅蛋白, 1953 年Keilin又從小牛肝、鯨肝分離出肝銅蛋白。1968 年McCord 和Fr idovich 根據(jù)血銅蛋白、肝銅

11、蛋白、腦銅蛋白皆有O- 2歧化活性, 將此酶命名為超氧化物歧化酶[4] 。</p><p>　　1.2.4 SOD的分類和分布</p><p>　　SOD廣泛存在于動、植物及微生物中[5]。根據(jù)其結(jié)合金屬種類不同, 可分為三類: 第一類為CuZn- SOD, 呈藍(lán)綠色, 相對分子量約為32kDa , 主要存在于真核細(xì)胞細(xì)胞漿、葉綠體和過氧化物酶體內(nèi); 第二類為Mn - SOD, 呈紫紅色,

12、 相對分子量約為40kDa , 主要存在于真核細(xì)胞線粒體和原核細(xì)胞中;第三類為Fe- SOD, 呈黃褐色, 相對分子量約為38.7kDa, 主要存在于原核細(xì)胞及一些植物中[4] 。</p><p>　　1.2.5 SOD的結(jié)構(gòu)與催化機(jī)理</p><p>　　1.2.5.1 CuZn- SOD的結(jié)構(gòu)</p><p>　　CuZn - SOD分子由兩個相同的亞基通過非共

13、價鍵疏水相互作用締合成一個“口袋”狀二聚體, 每個亞基含一個Cu2+ 和一個Zn2+ , 由半胱氨酸Cy s55和Cys144 的巰基構(gòu)成的二硫鍵對亞基締合起重要作用。位于“口袋”底部的Cu2+ 與四個組氨酸殘基( His - 44, - 46, - 61, - 118) 和一個H2O 配位, 形成一個畸變的四方錐結(jié)構(gòu), 構(gòu)成該酶的活性中心。而Zn2+則與三個組氨酸殘基( His- 61, - 69, - 78) 的咪唑氮和一個天冬門氨

14、酸殘基( Asp- 81) 的羧基氧原子配位, 形成扭曲的四面體結(jié)構(gòu)。Cu2+和Zn2+之間通過共同連接的組氨酸His61 形成“咪唑橋”結(jié)構(gòu)。位于活性中心的組氨酸直接影響酶的活性, 在“口袋”邊與Cu2+ 相距6 的位置, 有一個帶正電荷的精氨酸殘基Arg 143, 它能夠吸引O- 2進(jìn)入口袋, 并誘導(dǎo)O- 2進(jìn)入活性中心, 為催化反應(yīng)提供質(zhì)子, 加快反應(yīng)進(jìn)行。實驗證明, Cu2+和Zn2+對活性中心所起的作用不同, Cu2+為CuZ

15、n-SOD活性所必需, 而Zn2+與酶的穩(wěn)定性有關(guān)[1-5] 。</p><p>　　1.2.5.2 Mn-SOD的結(jié)構(gòu)</p><p>　　不同來源的Mn- SOD一級結(jié)構(gòu)同一性很高,并且參與形成活性中心及與金屬連接的氨基酸在所有Mn-SOD中都是保守的[6]。Mn- SOD是由203個氨基酸殘基構(gòu)成的四面體[1] , 結(jié)構(gòu)簡單, 每個亞基只含一個金屬離子[6] , Mn( Ⅲ) 處于三

16、角雙錐配位環(huán)境中, 其中一軸向配體為水分子, 另一軸向配體為蛋白質(zhì)輔基的配位基His-28, 另三個來自蛋白質(zhì)輔基的配基His-83、His-170和Asp-166位于赤道平面[7]。</p><p>　　1.2.5.3 Fe-SOD的結(jié)構(gòu)</p><p>　　Fe-SOD與Mn-SOD具有序列相似性, 并且含有相同的特征結(jié)構(gòu)域。其活性中心由3個His 、1個Asp和1個H2O扭曲配位四面

17、體配位而成。</p><p>　　1.2.5.4 SOD的催化機(jī)理[2]</p><p>　　超氧陰離子( O2- )是生物體內(nèi)主要的自由基,很多情況下O2-對機(jī)體是有害的, 它也是導(dǎo)致衰老的原因之一。而SOD是一類重要的清除氧自由基的抗氧化酶, 它能催化O2-使其發(fā)生歧化反應(yīng), 生成O2和H2O2; H2O2又在過氧化氫酶( CAT )的作用下, 生成無毒的H2O和O2 , 從而起到抗衰

18、老作用。醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為, SOD發(fā)揮作用時, 首先是金屬離子與O2- 形成內(nèi)界絡(luò)合物, 再發(fā)生后續(xù)反應(yīng)。因此,SOD的催化作用是通過其所含金屬的氧化和還原過程的電子得失來實現(xiàn)。</p><p>　　1.3 SOD的理化性質(zhì)</p><p>　　1.3.1 物理性質(zhì)</p><p>　　SOD為粉末狀，等電點4-6，半衰期短，分子量大，Cu.Zn—SOD呈綠色，Mn—

19、SOD呈紫色，F(xiàn)e—SOD呈黃褐色。</p><p><b>　　1.3.2化學(xué)性質(zhì)</b></p><p>　　弱酸性蛋白，抗氧化性，對pH、熱和蛋白酶水解等反應(yīng)一般穩(wěn)定。具有蛋白的一般化學(xué)性質(zhì)</p><p><b>　　SOD的研究進(jìn)展</b></p><p>　　超氧化物歧化酶是生物體防御氧

20、化損傷重要的生物酶。近些年, 國內(nèi)外學(xué)者除對動物SOD進(jìn)行研究外, 還對植物SOD和微生物SOD進(jìn)行了研究。</p><p>　　2.1　微生物SOD的研究進(jìn)展</p><p>　　近幾十年, SOD一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點。但他們的研究大多集中于從動物血液或臟器中提取SOD,易受原料來源、產(chǎn)品得率、穩(wěn)定性及安全性等方面的限制。微生物具有原料便宜易得, 可大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)勢, 因而, 近些

21、年很多學(xué)者都致力于用微生物發(fā)酵生產(chǎn)SOD的研究。上世紀(jì)80年代后, 美國和日本已先后開發(fā)了用發(fā)酵法生產(chǎn)SOD,大大降低了生產(chǎn)成本。目前, 國內(nèi)外在微生物SOD 的菌種選育、發(fā)酵工藝、分離提純、生理學(xué)研究、基因克隆表達(dá)及SOD應(yīng)用方面都取得一定的研究進(jìn)展[8、9] 。</p><p>　　2.2　植物SOD的研究進(jìn)展</p><p>　　植物細(xì)胞在正常代謝活動和逆境條件下均能產(chǎn)生活性氧。近年

22、來, 國內(nèi)外的專家學(xué)者主要研究了SOD與植物抗逆性的關(guān)系。研究表明, 在逆境條件下, 植物的抗性與植物體內(nèi)能否維持較高的SOD活性水平有關(guān)。環(huán)境脅迫能誘導(dǎo)植物SOD 基因的表達(dá)。當(dāng)前, 不同類型的SOD基因已被轉(zhuǎn)化到多種植物中, 有實驗結(jié)果表明, SOD在轉(zhuǎn)基因植物中的過量表達(dá)可以不同程度地提高植物對環(huán)境脅迫的抵抗能力[10、11] 。因此, 可利用基因工程方法來獲得抗逆植株。</p><p>　　2.3　動物S

23、OD的研究進(jìn)展</p><p>　　目前, SOD作為O2-特異清除劑, 已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及化妝品行業(yè)當(dāng)中。</p><p>　　2.3.1 SOD在醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用</p><p>　　SOD由于半衰期短、分子量大、易失活等缺點,不利于臨床使用, 而基因工程手段對SOD分子進(jìn)行化學(xué)修飾則成為近些年的研究熱點。實驗表明, 修飾酶不僅完全保留了天然酶的活性,

24、在耐熱、耐酸堿度、抵抗蛋白酶水解以及穩(wěn)定性方面也明顯優(yōu)于天然酶, 大大延長了它在體內(nèi)停留的時間[4]。當(dāng)前已有多種藥用SOD 應(yīng)用于臨床中, 主要集中于抗炎癥、抗衰老、抗輻射、抗腫瘤和自身免疫系統(tǒng)疾病等與活性氧損傷有密切關(guān)系的病癥中。</p><p>　　2.3.2 SOD 在食品工業(yè)中的應(yīng)用</p><p>　　SOD應(yīng)用于食品工業(yè)中, 主要是作為食品添加劑和重要的功能性基料。目前, 已

25、開發(fā)的產(chǎn)品有以大蒜為原料生產(chǎn)的大蒜粉、大蒜油, 以獼猴桃為原料生產(chǎn)的獼猴桃汁以及添加SOD的牛奶、咖啡、酸奶、啤酒等保健食品。</p><p>　　2.3.3 SOD在化妝品行業(yè)中的應(yīng)用</p><p>　　由于SOD具有抗衰老作用, 它已被廣泛應(yīng)用于化妝品中, 對于治療皺紋、雀斑、粉刺、色素沉著等具有明顯作用。因此, 含有SOD的化妝品倍受女性青睞。</p><p&g

26、t;　　3、 SOD研究展望</p><p>　　目前, SOD作為藥用酶用于臨床已有深入研究, 但由于其制備純化工藝復(fù)雜, 生產(chǎn)成本高, 因而在食品中應(yīng)用不是很廣泛, 鑒于從微生物中提取SOD存在諸多優(yōu)點, 因此用微生物發(fā)酵生產(chǎn)SOD有可能不經(jīng)過提純直接用于食品、化妝品及食品添加劑中。隨著研究進(jìn)一步加深, 利用微生物生產(chǎn)SOD進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化階段, 相信其在醫(yī)藥、食品、化妝品等方面應(yīng)用更加廣泛。</p>

27、<p>　　SOD酶檢測方法的確定</p><p>　　4.1 蛋白質(zhì)濃度的測定</p><p>　　用紫外分光光度法在A280nm/A260nm測定蛋白質(zhì)濃度.</p><p>　　4.2 SOD活性測定</p><p>　　用鄰苯三酚法在A420nm測定其活性。</p><p>　　酶活力單位定義：在2

28、5℃下，1ml反應(yīng)液中,每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)到50%時的酶量。</p><p><b>　　5、 器材與試劑</b></p><p><b>　　5.1 器材</b></p><p>　　研缽，移液管，洗耳球，洗瓶，5000r/min 的冷凍離心機(jī)，試管，玻璃棒，冰盤，水浴鍋，量筒，pH酸度計，層析住，鐵架臺，分

29、光光度計，移液槍。</p><p><b>　　5.2 材料及試劑</b></p><p><b>　　材料：新鮮大蒜</b></p><p>　　試劑：蒸餾水，pH7.8的磷酸鹽緩沖溶液(配制見附錄1)，氯仿-無水乙醇，丙酮，鄰苯三酚(配制見附錄2)</p><p>　　6、 SOD粗酶制品的獲取

30、</p><p>　　稱10g左右的大蒜至于冰浴的研缽（事先冷藏）研磨，使細(xì)胞破碎，再加入20ml 0.05mol/l pH7.8的磷酸鹽緩沖溶液[12]（事先冷藏），繼續(xù)研磨攪拌15min，使SOD充分溶解到緩沖液中，然后5000r/min,冷凍離心30min，棄去沉淀，得上清液即SOD粗酶液，并測其SOD活性及比活力。 </p><p>　　7、 SOD粗酶品的精制</p>

31、<p>　　7.1 氯仿-無水乙醇提取[12]</p><p>　　將上述剩余的上清液加入2倍體積的氯仿-無水乙醇混合溶劑（以3:5體積混合）攪拌15min，5000r/min冷凍離心10min,棄沉淀，取上清液稱其為SOD精制液1，并測其SOD活性及比活力。</p><p>　　7.2 熱變性處理[12]</p><p>　　將6.1中的剩余上清液置

32、于60℃水浴鍋中20 min ，棄沉淀，取上清液稱其為SOD精制液2，并測其SOD活性及比活力。</p><p>　　7.3 丙酮沉淀法提純[12]</p><p>　　用鹽酸調(diào)6.2中剩余的上清液pH5.0,加入0.6倍的預(yù)冷丙酮，攪拌均勻后5000r/min冷凍離心10min，棄沉淀，取上清液，再調(diào)pH值4.0，繼續(xù)加入0.2倍的預(yù)冷丙酮，5000r/min冷凍離心10min，收集沉淀

33、，將沉淀溶于10ml 0.05mol/l PH7.8的磷酸鹽緩沖溶液中，此時得到的SOD液稱其為SOD精制液3，隨后測其SOD活性及比活力。</p><p>　　7.4柱層析法再提純[12]</p><p>　　將6.3中剩余的磷酸SOD溶液上葡聚糖凝膠G-75層析住并用0.05mol/l PH7.8的磷酸鹽緩沖溶液洗脫，試管收集并編號，檢測每管的SOD活性，隨后收集SOD峰下的酶液稱其為

34、SOD精制液4，并測其SOD活性及比活力。</p><p>　　8、 SOD酶的鑒定</p><p>　　8.1 分光光度法測蛋白質(zhì)濃度</p><p>　　從粗酶液，精制液1，精制液2，精制液3和精制液4中各取0.5ml酶液，并分別按以下稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋，260nm/280nm測定吸光值,按公式計算蛋白質(zhì)濃度.</p><p>　　8.2

35、鄰苯三酚法測SOD活性[13]</p><p>　　對粗酶液，精制液1，精制液2，精制液3和精制液4進(jìn)行SOD活性測定：</p><p>　　加入鄰苯三酚后迅速混勻,準(zhǔn)確計時4min,加一滴濃鹽酸停止反應(yīng),420nm測吸光值.</p><p><b>　　8.3 計算</b></p><p>　　酶活力單位定義：在25℃

36、下，1ml反應(yīng)液中,每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)到50%時的酶量[13]。</p><p>　　計算公式:蛋白質(zhì)濃度（mg/ml)=（1.45*A280nm-0.74*A260nm)*稀釋倍數(shù)N</p><p>　　SOD活力（U/（ml*min）)=[（A對照-A樣液）/A對照*100%/50%]*5/(0.1*4)</p><p>　　比活力（U/(mg*mi

37、n)=SOD活力/蛋白質(zhì)濃度</p><p><b>　　9、 附錄</b></p><p><b>　　附錄1</b></p><p>　　pH7.8的磷酸鹽緩沖液的配制：（100 ml）0.2 mol/L Na2HPO4 91.5 ml；0.2 mol/L NaH2PO4 8.5 ml</p><

38、;p><b>　　附錄2</b></p><p>　　50mmol/L的鄰苯三酚的配制(10ml)：稱取鄰苯三氛0.063g,用10mmol/L HCL溶液溶解定容至10ml,避光保存。 </p><p><b>　　三 參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 丁書茂,楊旭.超氧化物歧化酶及其模擬化合物研究進(jìn)

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