養(yǎng)殖仿刺參對環(huán)境因子和病原的免疫應(yīng)答及抗病分子機(jī)理.pdf

1、為了完善刺參病害發(fā)生的理論和探討生態(tài)防治的方法，本文利用常規(guī)技術(shù)從患病仿刺參中分離了致病菌，并初步分析了其致病性;此外，模擬刺參養(yǎng)殖環(huán)境，測定了感染病菌后刺參相關(guān)非特異性免疫指標(biāo)的變化;利用病菌感染刺參構(gòu)建的cDNA文庫進(jìn)行EST分析，并鑒定了若干免疫相關(guān)基因;篩選了病原菌的拮抗菌，并對其拮抗特性進(jìn)行了研究。試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　采用微生物學(xué)方法鑒定了假交替單胞菌屬2株細(xì)菌和1株病毒，其中病菌Pseudoalteromonas sp

2、和病毒粒子對刺參有較強(qiáng)的感染性和致病性。實(shí)驗(yàn)表明，隨著病原菌感染濃度升高，刺參體腔液溶菌酶活性和AKP活性、SOD和CAT及PO的誘導(dǎo)活性、補(bǔ)體C3含量和呼吸爆發(fā)活性均顯著下降，而體腔液ACP活性和補(bǔ)體C4含量稍微上升;刺參體表粘液的SOD活性和溶菌酶活性對病菌感染較敏感，含量明顯受到抑制;而體表粘液中的CAT活性、ACP活性和補(bǔ)體C4含量在病原菌感染濃度較低時(shí)增加、在感染濃度較高時(shí)減少。病毒感染條件下，刺參體液中的溶菌酶、酸性磷酸酶、

3、 SOD和PO活性降低，而CAT活性增強(qiáng)，體腔液中的免疫酶活性比體表粘液中的免疫酶活性變化更明顯。
　　當(dāng)水體中氨氮濃度較高時(shí)，刺參體腔液中的超氧物歧化酶(SOD)和堿性磷酸酶(ALP)活性降低、溶菌酶(LSZ)活性升高;而在感染病菌的情況下，體腔液SOD、ALP和LSZ活性下降，而GPx活性持續(xù)上升;在中等氨氮濃度時(shí)，體腔液酶活性減少幅度最小或增加幅度最大。硒可誘導(dǎo)動(dòng)物的抗病毒和抗病菌活性，亞硒酸鈉濃度較低時(shí)，隨著亞硒酸鈉濃度增

4、加，刺參體液超氧物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、溶菌酶(LSZ)、酚氧化酶(PO)和堿性磷酸酶(ALP)活性升高;而在感染病原菌的情況下，體液SOD、GPx和LYZ的活性表現(xiàn)為先升高后下降的趨勢，PO和ALP的活性則持續(xù)上升。在高濃度NO2-條件下，刺參體腔液SOD、CAT、AKP和PO的誘導(dǎo)活性下降，LSZ和GPx活性顯著被抑制;病原菌感染時(shí)加劇刺參體腔液CAT、GPx、LSZ和PO活性被抑制，但體腔液SOD活性被誘

5、導(dǎo)升高;缺氧處理刺參時(shí)，體腔液ACP誘導(dǎo)活性被抑制，而AKP活性被促進(jìn);分析表明，病原菌感染可促進(jìn)體腔液ACP誘導(dǎo)活性，明顯拮抗高濃度NO2-對AKP活性的抑制。在較低的適宜鹽度條件下，病原菌感染可促進(jìn)刺參體液SOD、GPx和AKP活性的誘導(dǎo)水平，而鹽度過高時(shí)，病原菌感染加劇使刺參體液SOD、GPx和AKP活性水平降低;此外，適宜鹽度處理下，刺參體液LSZ活性均可被誘導(dǎo)，而病原菌感染后，體液LSZ的誘導(dǎo)活性被抑制。水溫低于23℃時(shí)，升溫

6、和病原菌感染均可促進(jìn)刺參體液SOD、GPx、LSZ和PO的活性;高溫脅迫條件下，病原菌感染可明顯抑制體液上述酶的活性;此外，水溫上升可抑制刺參體液AKP活性，而病原菌感染誘導(dǎo)AKP活性。緩慢升高溫度可以增強(qiáng)刺參體液的SOD和PO活性，但體液GPx和LSZ活性變化不大，而高溫預(yù)處理后刺參體液SOD和LSZ活性明顯下降;因此，適當(dāng)?shù)臏囟却碳た蓽p少刺參的發(fā)病。
　　構(gòu)建的cDNA文庫庫容為3.24×105cfu/mL，插入片段大小為0.

7、8～2.5kb，文庫質(zhì)量較高。對文庫進(jìn)行測序和初步的生物信息學(xué)處理，得到了高質(zhì)量的表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)1106條。經(jīng)過軟件拼接，共得到533條單基因簇，包含165個(gè)序列重疊群和368條單一序列。同源序列基因分析表明，仿刺參cDNA文庫中有25種免疫相關(guān)的基因。采用real-time PCR技術(shù)對免疫相關(guān)基因進(jìn)行分析，證明了體腔液中血清凝集素、補(bǔ)體C3和補(bǔ)體3類似蛋白基因的表達(dá)水平顯著升高，提示其在刺參免疫防御中發(fā)揮作用。
　　

8、為了開發(fā)更多有效的病原拮抗菌用于刺參疾病防治，本文利用點(diǎn)種法和濾紙片法篩選到了5株拮抗菌，利用牛津杯法進(jìn)一步確認(rèn)YAAJ6和YASM12拮抗菌株的活性最高?；铙w試驗(yàn)表明，該2株拮抗菌是通過促進(jìn)體腔液SOD、ALP、LSZ活性和細(xì)胞吞噬活性而提高刺參對病原菌的抗性。深入的研究表明，拮抗菌胞外產(chǎn)物在28℃或pH8.0時(shí)抑菌活性最高，但對蛋白酶K和鏈霉素蛋白酶敏感。
　　本研究證實(shí)，病原細(xì)菌和病毒病原均可導(dǎo)致刺參非特異性免疫力的下降;水