PPV、PRV和PCV-2三重PCR與PCV-2 LAMP檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、本研究應(yīng)用PCR技術(shù)和TaqMan(R)探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，建立豬細(xì)小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)單項(xiàng)與三重二溫式PCR快速檢測(cè)方法及單項(xiàng)與三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)方法;探索應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)，建立簡(jiǎn)單、靈敏、特異的PCV-2檢測(cè)方法。所建立檢測(cè)技術(shù)為實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)上述豬主要DNA病毒提供了可靠的方法，研究分為三個(gè)部分:
　　 一、PPV、PRV和PC

2、V-2單項(xiàng)及三重二溫式PCR方法的建立通過(guò)對(duì)GenBank登錄的PPV、PRV和PCV-2核苷酸序列比對(duì)分析，選出PPV的VP2基因、PRV的gH基因和PCV-2的ORF2基因?yàn)橄鄬?duì)保守區(qū)域，利用生物學(xué)軟件篩選設(shè)計(jì)出3對(duì)高熔解溫度特異性引物，目的片段大小分別為142 bp(PPV)、300 bp(PRV)和469 bp(PCV-2)。經(jīng)條件優(yōu)化、敏感性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)及重復(fù)性試驗(yàn)，建立了單項(xiàng)與三重二溫式PCR檢測(cè)方法。整個(gè)三重二溫式PC

3、R反應(yīng)過(guò)程約需66 min，比三個(gè)常規(guī)單項(xiàng)PCR分別檢測(cè)所用總時(shí)間減少了近70％，比常規(guī)三重PCR節(jié)省了至少20％的時(shí)間;對(duì)三者陽(yáng)性質(zhì)粒的檢出敏感性低至200拷貝;對(duì)其它豬常見(jiàn)病原（副豬嗜血桿菌、鏈球菌、CSFV、PRRSV、大腸桿菌和JEV）檢測(cè)無(wú)交叉反應(yīng);有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。
　　 二、PPV、PRV和PCV-2單項(xiàng)與三重FQ-PCR檢測(cè)方法的建立根據(jù)TaqMan(R)探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理，運(yùn)用引物、探針設(shè)計(jì)軟件對(duì)

4、PPV的VP2基因、PRV的gH基因及PCV-2的ORF2基因分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物和一條特異性探針，探針報(bào)告集團(tuán)依次為:JOE(PPV)、TAMARA(PRV)和FAM(PCV-2)。經(jīng)條件優(yōu)化、敏感性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)及批內(nèi)批間重復(fù)試驗(yàn)，建立了單項(xiàng)與三重FQ-PCR檢測(cè)方法。整個(gè)反應(yīng)過(guò)程在70min內(nèi)完成;對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒的檢出敏感性低至10拷貝;對(duì)其它豬常見(jiàn)病原檢測(cè)無(wú)交叉反應(yīng);批內(nèi)批間重復(fù)試驗(yàn)CV％均小于3％，具有良好重復(fù)性;擴(kuò)增效率E＞95％

5、，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)R2＞0.99，具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。
　　 三、PCV-2 LAMP檢測(cè)方法的建立根據(jù)LAMP技術(shù)原理，選取PCV-2的ORF2基因，利用在線(xiàn)Primer Explorer3.0軟件設(shè)計(jì)4條特異性引物。經(jīng)條件優(yōu)化、敏感性試驗(yàn)和特異性試驗(yàn)，建立了PCV-2LAMP檢測(cè)方法。該方法對(duì)PCV-2基因組DNA的檢出敏感性達(dá)0.5 pg;對(duì)其它豬常見(jiàn)病原檢測(cè)無(wú)交叉反應(yīng);陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切驗(yàn)證，為預(yù)期條帶;反應(yīng)產(chǎn)物中加入SYBR

6、GreenⅠ染料，可根據(jù)顏色變化，肉眼快速判斷結(jié)果。
　　 用所建立三聯(lián)PCR方法對(duì)205份臨床疑似病料樣品進(jìn)行檢測(cè)，分別與常規(guī)單項(xiàng)PCR方法對(duì)比。結(jié)果顯示，單項(xiàng)和三重二溫式PCR方法對(duì)PPV、PRV和PCV-2檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)單項(xiàng)PCR方法的總符合率均在97％以上;單項(xiàng)和三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)各相關(guān)病原檢出率均高于常規(guī)單項(xiàng)PCR方法:PPV高出0.38％，PRV高出0.97％，PCV-2高出1.96％。用所建立PCV-2