GsCBRLK和GsTS2基因改良農(nóng)菁1號(hào)苜蓿耐鹽性的研究.pdf

1、土壤鹽漬化和次生鹽漬化問題在世界范圍內(nèi)廣泛存在，全世界有鹽漬土壤約9.5×106km2，我國(guó)鹽漬土面積約7.5×105km2，嚴(yán)重制約我國(guó)乃至世界的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。對(duì)于鹽堿化地區(qū)，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為改良鹽堿地最經(jīng)濟(jì)有效的方法是種植耐鹽植物。利用基因工程手段進(jìn)行分子育種，遺傳改良具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值植物品種的耐鹽性狀，培育耐鹽轉(zhuǎn)基因植物新材料和新品種，已成為推進(jìn)鹽漬土地改造利用、維持生態(tài)平衡的有效方法。紫花苜蓿(Medicago sativa L.)素有“牧

2、草之王”的美稱，是世界上栽培最早、分布最廣，也是最優(yōu)良、最重要的一種優(yōu)質(zhì)豆科牧草。在水土保持，防止土壤鹽堿化、荒漠化以及改良環(huán)境等方面起著重要的作用。盡管苜蓿為中等耐鹽植物，但在鹽脅迫條件下，苜蓿的出苗、生長(zhǎng)及飼草產(chǎn)量也會(huì)受到抑制，因此需要培育更耐鹽的苜蓿新品種。植物的耐鹽性是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的問題，特別是高等植物的耐鹽性由多基因控制，是多基因協(xié)同作用的結(jié)果。通過(guò)分子育種導(dǎo)入個(gè)別功能基因?qū)χ参锟鼓嫘缘母牧夹Ч钟邢?，即使進(jìn)行多基因的聯(lián)合導(dǎo)

3、入，各基因間的相互協(xié)調(diào)問題也很難解決。而一些在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中起調(diào)控作用的蛋白質(zhì)因子，特別是激酶蛋白，單基因的表達(dá)就可以啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，激活下游眾多功能基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和功能蛋白的活化，從而達(dá)到綜合改良作物抗逆性的效果。野生大豆(Glycine soja Sieb.Et Zucc.)具有豐富的耐逆基因資源，是耐逆基因克隆的理想材料。
　　 本研究選取實(shí)驗(yàn)室先前從野生大豆中克隆得到的耐鹽蛋白激酶基因GsCBRLK和GsST2，通過(guò)

4、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別轉(zhuǎn)化農(nóng)菁1號(hào)苜蓿(Medicago sativa L.cv.Nongjing No.1)，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，并對(duì)轉(zhuǎn)基因受體農(nóng)菁1號(hào)苜蓿的苗期耐鹽性進(jìn)行初步研究，確定了農(nóng)菁1號(hào)苜蓿的耐鹽程度。以此為參考對(duì)轉(zhuǎn)GsCBRLK和GsST2基因農(nóng)菁1號(hào)苜蓿進(jìn)行了耐鹽性分析，最終獲得了耐鹽性明顯提高的轉(zhuǎn)基因苜蓿。主要研究結(jié)果如下：⑴獲得轉(zhuǎn)GsCBRLK和GsST2基因農(nóng)菁1號(hào)苜蓿。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將GsCBRLK基因轉(zhuǎn)入農(nóng)菁1號(hào)苜蓿

5、，獲得抗性植株110株；PCR陽(yáng)性植株51株，PCR陽(yáng)性率46％；對(duì)部分PCR陽(yáng)性植株進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，證明了GsCBRLK基因能夠在轉(zhuǎn)基因植株中轉(zhuǎn)錄并且超量表達(dá)。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將GsST2基因轉(zhuǎn)入農(nóng)菁1號(hào)苜蓿，獲得抗性植株46株；PCR陽(yáng)性植株18株，PCR陽(yáng)性率39％；對(duì)部分PCR陽(yáng)性植株進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，證明了GsST2基因能夠在轉(zhuǎn)基因植株中轉(zhuǎn)錄并且超量表達(dá)。⑵確定了農(nóng)菁1號(hào)苜蓿耐鹽篩選濃度。為了對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因苜蓿進(jìn)行耐

6、鹽性分析，本研究對(duì)轉(zhuǎn)基因受體農(nóng)菁1號(hào)苜蓿的苗期耐鹽性進(jìn)行初步研究，確定了農(nóng)菁1號(hào)苜蓿的耐鹽篩選濃度：測(cè)定農(nóng)菁1號(hào)苜蓿在不同時(shí)間點(diǎn)、不同鹽脅迫濃度下的丙二醛(MDA)、葉綠素(Ch1)和脯氨酸(Pro)含量，表明：隨著鹽濃度的增加，MDA含量逐漸升高，但隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，在200、300 mmol/L NaCl處理下，農(nóng)菁1號(hào)苜蓿的MDA含量表現(xiàn)出先增加，后下降，然后又上升的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。隨著脅迫濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，苜蓿受到的鹽害逐漸

7、增大，Ch1含量逐漸降低，Pro含量大量累積，但Pro累積程度與其耐鹽表現(xiàn)并不完全一致。觀察農(nóng)菁1號(hào)苜蓿在不同時(shí)間點(diǎn)、不同鹽脅迫濃度下的表型情況，表明：低濃度鹽脅迫對(duì)其生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，農(nóng)菁1號(hào)苜蓿具有較強(qiáng)的耐鹽性，能夠抵抗持續(xù)15 d的200mmol/L NaCl的脅迫，但難以耐受300 mmol/L NaCl的脅迫，特別是400 mmol/L NaCl的高鹽脅迫。由此對(duì)轉(zhuǎn)基因農(nóng)菁1號(hào)苜蓿進(jìn)行耐鹽性分析時(shí)，選定300 mmol/L Na

8、Cl作為脅迫濃度，400 mmol/L NaCl作為致死濃度。⑶獲得耐鹽性提高的轉(zhuǎn)GsCBRLK和GsST2基因農(nóng)菁1號(hào)苜蓿。對(duì)轉(zhuǎn)GsCBRLK和GsST2基因農(nóng)菁1號(hào)苜蓿進(jìn)行了耐鹽性分析。高濃度鹽處理下的表型以及相關(guān)生理生化指標(biāo)(質(zhì)膜透性、丙二醛含量、葉綠素含量、SOD活性)的分析結(jié)果均表明，目的基因在農(nóng)菁1號(hào)苜蓿中的超量表達(dá)明顯提高了轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐鹽性：對(duì)獲得的轉(zhuǎn)GsCBRLK基因苜蓿進(jìn)行了耐鹽性分析。在300 mmol/L NaC

9、l條件下進(jìn)行脅迫處理，測(cè)定處理0、3、6、9、12、15 d時(shí)的質(zhì)膜透性、丙二醛和葉綠素含量，以及脅迫15 d時(shí)的SOD的活性；并統(tǒng)計(jì)400 mmol/L NaCl處理15d時(shí)植株的死亡率。結(jié)果顯示：300 mmol/L高鹽脅迫15 d后轉(zhuǎn)GsCBRLK基因苜蓿仍能正常生長(zhǎng)，而野生型苜蓿則遭受鹽害嚴(yán)重；轉(zhuǎn)GsCBRLK基因苜蓿的相對(duì)電導(dǎo)率極顯著低于野生型，MDA含量也顯著低于野生型，而Ch1含量和SOD活性都顯著高于野生型；在400 m

10、mol/L NaCl處理下，轉(zhuǎn)GsCBRLK基因苜蓿的死亡率(13.33％和10％)明顯低于野生型植株(63.33％)。表明GsCBRLK基因的超量表達(dá)明顯提高了轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐鹽性。對(duì)獲得的轉(zhuǎn)GsST2基因苜蓿進(jìn)行了耐鹽性分析。在300 mmol/L NaCl條件下進(jìn)行脅迫處理，測(cè)定處理0、3、6、9、12、15 d時(shí)的質(zhì)膜透性、丙二醛和葉綠素含量，以及脅迫15d時(shí)的SOD的活性；并統(tǒng)計(jì)400 mmol/L NaCl處理15d時(shí)植株的死