苜蓿耐鹽的基因工程改良研究.pdf

1、紫花苜蓿（Medicago sativa）在分類學(xué)上屬于雙子葉植物（Dicotyledoneae）豆科（Leguminosae）苜蓿屬（Medicago），是世界上分布最廣的一種比較耐鹽的多年生豆科牧草，但在中重度鹽堿地實(shí)際栽培中其耐鹽性尚需提高。傳統(tǒng)的遺傳育種難以打破種間隔離的限制，轉(zhuǎn)基因技術(shù)有可能解決這一問題。SOS（salt overly sensitive）信號途徑對植物的耐鹽性至關(guān)重要，其重要生理功能就是使植物在鹽脅迫下進(jìn)行離

2、子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和提高NaCl耐性。本論文采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，以苜蓿下胚軸、子葉和葉片來源的胚性愈傷組織和經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的葉片、子葉為受體，首次把將雙子葉植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）來源的基因SOS1、SOS2-SOS3和SOS1-SOS2-SOS3導(dǎo)入中苜1號中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，并建立了高效的苜蓿再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系。PCR檢測初步證明.SOS基因已經(jīng)整合進(jìn)苜?；蚪M。瓶內(nèi)試管苗試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)化植株的N

3、aCl抗性比對照植株有了顯著提高，在含6‰NaCl的培養(yǎng)基上生長正常。生理檢測進(jìn)一步證明了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽功能。 1.最佳種子消毒方案：以中苜1號飽滿種子為材料，75％的酒精消毒3 min后，用0.1％升汞處理30min，然后用無菌水沖洗6次，重新置于無菌水中搖床上過夜處理，無菌水再洗滌種子兩次，然后接種于MS（B5）培養(yǎng)基上。14天后統(tǒng)計(jì)污染率是0，發(fā)芽率100％，后繼調(diào)查所萌發(fā)的植株均生長正常。 2.愈傷組織的誘導(dǎo)與

4、增殖分化：中苜1號種子、下胚軸、子葉和葉片均能誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，并再生成完整植株。胚性愈傷組織的誘導(dǎo)從快到慢順序是下胚軸（兩個月）、子葉和葉片（兩個半月）、種子（四個半月）。從胚性愈傷組織到再生成植株僅需半個月。實(shí)驗(yàn)摸索的最佳方案是：下胚軸和種子在D4培養(yǎng)基上培養(yǎng)20天后轉(zhuǎn)到D1培養(yǎng)基上培養(yǎng)14天，然后轉(zhuǎn)接入MS（B5）0培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)；子葉和葉片在XGMM培養(yǎng)基上培養(yǎng)40天后，轉(zhuǎn)接入MS（B5）0。 3.通過比較三種壯苗生根

5、培養(yǎng)基，得到最佳配方是MS（B5）D。 4.實(shí)驗(yàn)得到的最佳愈傷組織PPT篩選濃度為6mg/L；無菌苗的最佳PPT篩選濃度是2mg/L。 5.本實(shí)驗(yàn)從基因型、外植體類型、菌株類型、侵染時(shí)間、AS的使用及侵染前用70％酒精預(yù)處理外植體等方面研究了影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的因素，得出的結(jié)論是：中苜1號紫花苜蓿的轉(zhuǎn)化效率較高，是較理想的基因型；胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率最高，且再生出植株所需時(shí)間最短，缺點(diǎn)是再生率偏低；EHA105菌株的抗

6、性愈傷組織頻率是LBA4404的4.46倍；最佳侵染時(shí)間是120min；侵染前用70％酒精預(yù)處理外植體并使用AS能提高抗性愈傷組織頻率。從而對轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化。 6.共培養(yǎng)后的愈傷組織在MS6P/MS100H培養(yǎng)基上篩選20天后（可以挑選黃綠色的愈傷繼續(xù)篩選1-2次，以提高陽性苗率），將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到MS（B5）0培養(yǎng)基上分化，進(jìn)一步再生成植株。實(shí)驗(yàn)的先再生后篩選方案是：共培養(yǎng)后的葉片或子葉在XGMM培養(yǎng)基上培養(yǎng)40天后，

7、轉(zhuǎn)移到MS（B5）0培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，再生出的植株轉(zhuǎn)入MS2P培養(yǎng)基上篩選2-3次。 7.轉(zhuǎn)SOS2-SOS3基因苜蓿抗性愈傷組織GUS染色結(jié)果是轉(zhuǎn)基因愈傷呈現(xiàn)藍(lán)色，而對照沒有呈現(xiàn)藍(lán)色。表明該基因可以在苜?；蚪M表達(dá)。 8.將經(jīng)過60-120天抗性篩選獲得的轉(zhuǎn)基因植株提取基因組DNA做PCR檢測，均得到了目標(biāo)陽性條帶，其中SOS1的PCR陽性率為31.5％； SOS2-SOS3的PCR陽性率為41.3％； SOS1-SO

8、S2-SOS3的PCR陽性率為59％。分析PCR陽性率非常高的主要原因是：（1）使用了經(jīng)過優(yōu)化的遺傳轉(zhuǎn)化體系；（2）所檢測植株均經(jīng)過了60-120天抗性篩選，大部分未轉(zhuǎn)化植株已經(jīng)被篩死。 9.高濃度的鹽分將導(dǎo)致植物產(chǎn)生氧化脅迫。本實(shí)驗(yàn)以PCR陽性轉(zhuǎn)SOS2-SOS3基因株系4-3、4-5和未轉(zhuǎn)基因的對照植株試管苗為材料，分別測定了0、0.3％、0.6％和0.9％ NaCl脅迫下的相關(guān)抗逆生理生化指標(biāo)。結(jié)果表明，鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因株系