基于大豆種子油體系統(tǒng)表達(dá)重組白介素IL-21的研究.pdf

1、種子作為植物重要儲(chǔ)藏器官之一,為高效表達(dá)外源重組藥物蛋白提供了理想的載體。與其他植物生產(chǎn)系統(tǒng)相比,植物種子反應(yīng)器具有多方面的優(yōu)勢(shì),包括表達(dá)水平較高,重組蛋白活性穩(wěn)定,易于儲(chǔ)藏和運(yùn)輸以及便于加工,分離和純化等。在過(guò)去的二十年中,利用植物種子作為反應(yīng)器表達(dá)了一系列重組藥物蛋白,部分藥物蛋白甚至已進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)階段。植物細(xì)胞中合成的蛋白一般存在于細(xì)胞質(zhì)或是通過(guò)分泌途徑定位到各類(lèi)細(xì)胞器或是質(zhì)外體。重組蛋白在細(xì)胞中的定位表達(dá)不僅影響其表達(dá)水平和穩(wěn)

2、定積累,同時(shí)也深刻影響重組蛋白的翻譯后修飾(組裝與折疊、二硫鍵的形成、多亞基組裝等)及其生物學(xué)功能。油體是植物種子中貯存油脂的亞細(xì)胞器,其周?chē)采w了一層高密度的低分子量(15-26 kDa)疏水油體蛋白。通過(guò)與油體蛋白的融合表達(dá),不僅可以實(shí)現(xiàn)重組蛋白油體表面的靶向定位和穩(wěn)定表達(dá),同時(shí)為后期重組蛋白分離純化提供了十分便利的條件。利用油體系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白已成為目前植物生物反應(yīng)器研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容之一。
　　本研究基于大豆種子高蛋白(~

3、40％)和高油脂(~20％)含量的特點(diǎn),采用油體蛋白分子介導(dǎo)方法,通過(guò)大豆24kD油體蛋白Oleosin與白介素IL-21的融合,實(shí)現(xiàn)重組融合蛋白在轉(zhuǎn)基因大豆種子油體中的高效和穩(wěn)定表達(dá),從而為重組藥物蛋白IL21及其他高附加值重組蛋白的規(guī)?；?、低成本生產(chǎn)提供一個(gè)高效的生產(chǎn)平臺(tái),同時(shí)也為進(jìn)一步拓展大豆產(chǎn)品功能形態(tài),大幅度增加大豆產(chǎn)品附加值提供一個(gè)新的技術(shù)思路。本研究主要獲得如下實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.根據(jù)豆科植物偏愛(ài)性密碼子,對(duì)白介素I

4、L21基因序列(489bp)進(jìn)行人工優(yōu)化合成。采用常規(guī)分子操作手段,將IL21基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA3300-bscp-Oleosin-gfp載體中,替換載體中的gfp基因序列,構(gòu)建表達(dá)載體pCAMBIA3300-bscp-Oleosin-IL21;
　　2.在已建立的大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化技術(shù)體系的基礎(chǔ)上,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法,將Oleosin-IL21基因?qū)氲酱蠖怪参锘蚪M中,共獲得PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因大豆植株30株。轉(zhuǎn)

5、基因植株在表型上與對(duì)照受體大豆品種SN9沒(méi)有明顯差異;
　　3. Southern blot雜交檢測(cè)結(jié)果表明外源基因IL-21已整合到大豆基因組中。對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因大豆植株進(jìn)行PCR跟蹤檢測(cè)結(jié)果表明,目的基因已獲得穩(wěn)定遺傳。
　　4.采用RT-PCR、Western雜交等方法,初步確定外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中獲得表達(dá)。下一步將通過(guò)ELISA技術(shù)分析外源重組蛋白Oleosin-IL21的表達(dá)水平和穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ)上,利用油體親脂疏