IL-21與STAT3在哮喘小鼠肺組織的表達(dá)及作用.pdf

1、背景：支氣管哮喘（簡稱哮喘）(bronchial asthma，asthma)是呼吸系統(tǒng)常見病、多發(fā)病之一，對人類健康構(gòu)成了很大的威脅。世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，全球約有3億哮喘患者，其中每年約有一千五百萬人因?yàn)樵摬《鴨适趧幽芰?。?jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國至少也有1500萬到2000萬哮喘患者，世界各地支氣管哮喘的發(fā)病率、死亡率都呈逐年增高趨勢，每年造成了異常巨大的經(jīng)濟(jì)損失，哮喘已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。哮喘反復(fù)發(fā)作且病因復(fù)雜，在宿主易感

2、因素與環(huán)境因素相互作用下，以慢性氣道炎癥和氣道重塑為基本病理生理改變的綜合征，是一種可以控制但很難治愈的疾病。研究哮喘的發(fā)病機(jī)理，預(yù)防和控制哮喘變態(tài)反應(yīng)性炎癥的發(fā)生和發(fā)展，受到越來越多研究者的關(guān)注。
　　 在哮喘氣道炎癥發(fā)展過程中，CD4+T細(xì)胞群中的初始T細(xì)胞經(jīng)變應(yīng)原誘導(dǎo)激活后成為Th0細(xì)胞，并繼續(xù)朝Th2細(xì)胞方向分化，生成大量的Th2細(xì)胞，Th2細(xì)胞占據(jù)優(yōu)勢地位，可大規(guī)模誘發(fā)下游的IgE和/或非IgE介導(dǎo)的Th2炎癥。哮喘發(fā)

3、病過程中，炎性細(xì)胞在氣道組織中的浸潤、聚集、激活和釋放是其主要特征，在此過程中細(xì)胞因子發(fā)揮了重要作用。慢性炎癥反復(fù)刺激和上皮結(jié)構(gòu)的破壞可以引起哮喘的氣道重塑。目前，氣道炎癥與氣道重塑作為哮喘的兩個病理特征逐漸被人們所接受。引起氣道重塑的各種細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等在氣道重塑中發(fā)揮作用的機(jī)制尚未完全明確。
　　 白細(xì)胞介素21(IL-21)是2000年發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，屬于Ⅰ型細(xì)胞因子家族，主要是由CD4+Th2細(xì)胞合成和分泌，與I

4、L-2、IL-4和IL-15具有同源性。自從發(fā)現(xiàn)了IL-21以后，關(guān)于它的生物學(xué)功能成為了研究的熱點(diǎn)。IL-21的效應(yīng)是多樣的，主要是由于IL-21的受體分布廣泛。IL-21開始時被認(rèn)為是激活的外周血T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，現(xiàn)在被認(rèn)為可以由一系列分化型CD4+Th細(xì)胞合成，生物學(xué)功能主要是刺激T細(xì)胞增殖、NK細(xì)胞增殖和分化以及CD40特異性應(yīng)答B(yǎng)細(xì)胞的增殖。IL-21受體(IL-21R)表達(dá)于淋巴造血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞

5、。實(shí)驗(yàn)證明，IL-21在先天性免疫、適應(yīng)性免疫及細(xì)胞內(nèi)的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用，與多種自身免疫性疾病及炎性疾病有關(guān)，例如類風(fēng)關(guān)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化病、炎癥性腸病、過敏性疾病，對于這些疾病有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 IL-21在Th細(xì)胞的分化方面起了關(guān)鍵作用，支氣管哮喘是一種免疫異常導(dǎo)致的變態(tài)反應(yīng)性疾病，免疫功能紊亂在哮喘發(fā)病中起十分重要的作用,T細(xì)胞的不同方向的分化決定哮喘疾病是否發(fā)生，Th1/Th2失衡及Th17/

6、Treg失衡理論一直是研究的熱點(diǎn)。Th1/Th2細(xì)胞之間處于相互抑制狀態(tài)，正常情況下，Th1/Th2細(xì)胞處于恒定狀態(tài)，哮喘患者Th1細(xì)胞功能下降，Th2細(xì)胞功能異常增高。Treg細(xì)胞數(shù)量減少、其抑制炎癥反應(yīng)的功能降低，而Th17細(xì)胞過度表達(dá)介導(dǎo)氣道炎癥。IL-21是CD4+Th2型細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，可以促進(jìn)Th17細(xì)胞的分泌，有人認(rèn)為Th17細(xì)胞又是IL-21生成的一個重要來源，由此推斷IL-21可能參與哮喘疾病的發(fā)病。2009年，R

7、ajshekhar Chatterjee第一次報道了IL-21基因多態(tài)性與哮喘顯著相關(guān)。
　　 IL-21功能的發(fā)揮依靠其受體的共用γ鏈，主要通過JAK-STAT途徑傳遞信號。IL-21R蛋白由538個氨基酸組成，與IL-2 Rβ鏈、IL-4 Rα鏈和IL-9 R有同源性，N端有4個高度保守的Cys殘基，跨膜區(qū)有“WSXWS”序列，胞漿區(qū)存在經(jīng)典的信號傳遞亞單位box1和box2基序，表明該受體具有信號傳導(dǎo)功能。IL-21與IL

8、-21R結(jié)合時，主要通過與γc的偶聯(lián)，激活JAK1和JAK3(特別是JAK3)，活化的JAK酪氨酸激酶使STAT1和STAT3發(fā)生磷酸化，磷酸化STAT移行到細(xì)胞核內(nèi)，起到活化T細(xì)胞核因子(NFAT)的作用，誘導(dǎo)IL-21基因表達(dá)。JAK-STAT途徑參與許多細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而影響Th細(xì)胞分化和Th細(xì)胞免疫偏移，是哮喘發(fā)病重要的信號通路。哮喘小鼠肺組織IL-21及IL-21R表達(dá)未見報道。本研究建立慢性哮喘小鼠動物模型，用不同的實(shí)驗(yàn)方法

9、觀察IL-21、IL-21R、STAT3、P-STAT3在哮喘小鼠肺組織的表達(dá)，使用地塞米松及酪氨酸激酶(JAK，janus Kinnase)抑制劑AG490進(jìn)行干預(yù)，觀察IL-21對哮喘氣道炎癥及氣道重塑的影響，探討IL-21/STAT3信號通路在哮喘發(fā)病中所起的作用。
　　 研究目的：
　　 1、用不同的實(shí)驗(yàn)方法觀察IL-21、IL-21R在小鼠及哮喘小鼠肺組織中的表達(dá)，觀察IL-21及其受體與氣道炎癥、氣道重塑指標(biāo)

10、的關(guān)系。
　　 2、觀察STAT3、活化后的STAT3(p-STAT3)在哮喘小鼠的表達(dá)及其與氣道炎癥、氣道重塑的關(guān)系。
　　 3、使用JAK通路抑制劑AG490腹腔注射后觀察哮喘小鼠氣道炎癥及氣道重塑指標(biāo)的變化，觀察肺組織總STAT3、p-STAT3的表達(dá)變化，觀察IL-21表達(dá)的變化。
　　 4、使用地塞米松干預(yù)哮喘小鼠后，觀察對哮喘小鼠氣道炎癥的改變及對IL-21/STAT3信號通路的影響。
　　

11、研究方法：
　　 1、動物模型的建立和分組
　　 SPF級BALB/C雌性小鼠，共44只，隨機(jī)分為4組，分別為對照組、哮喘組、AG490組、地塞米松組，每組11只。哮喘組于第1天、第14天每只小鼠腹腔注射0.2mL致敏液，致敏液含卵蛋白(OVA，Grade V)10ug，氫氧化鋁凝膠100ug，第21天開始，霧化吸入25 g/L的OVA溶液30 min，每周3次，共8周。對照組以生理鹽水代替OVA。地塞米松組在每次霧化O

12、VA溶液前0.5 h腹腔注射10mg/kg地塞米松溶液。AG490組是于第21天開始腹腔注射AG490，按每只小鼠每次450ug，每周3次，連續(xù)8周，每5mgAG490用0.5mL二甲基亞砜(0.05％)、9.5mL雙蒸水充分溶解。
　　 2、IL-21及IL-21R在慢性哮喘小鼠肺組織的表達(dá)
　　 在末次霧化吸入24h后，左肺行肺泡灌洗，收集灌洗液(BALF)，離斷頸椎處死小鼠。左肺組織放入液氮罐用于提取RNA及總蛋白

13、。右肺組織石蠟包埋切片行HE染色，并用免疫組化染色觀察IL-21、IL-21R在小鼠肺組織中的表達(dá)，采用熒光定量PCR法檢測肺組織IL-21 mRNA、IL-21R mRNA的表達(dá)，western blot法檢測IL-21蛋白、IL-21R蛋白的表達(dá)。
　　 3、IL-21及IL-21R與氣道炎癥和氣道重塑的關(guān)系
　　 肺泡灌洗液離心后，取沉渣用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞分類及計(jì)數(shù)，重點(diǎn)觀察細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞

14、計(jì)數(shù)變化;肺組織行HE染色觀察氣道及肺組織病理學(xué)改變;肺組織石蠟切片HE染色后，用IPP6.0圖像分析軟件分析單位長度基底膜氣道壁面積(氣道壁厚度，WAt/Pbm)、單位長度基底膜的氣道平滑肌面積(平滑肌厚度， WAm/Pbm);分析IL-21、IL-21R與WAt/Pbm、WAm/Pbm指標(biāo)的相關(guān)性。
　　 4、STAT3、p-STAT3在慢性哮喘小鼠肺組織的表達(dá)及使用JAK通路抑制劑AG490干預(yù)后的表達(dá)變化
　　

15、用western blot及免疫組化方法檢測小鼠肺組織p-STAT3蛋白表達(dá)，用熒光定量PCR檢測肺組織STAT3的表達(dá);觀察哮喘小鼠使用了AG490干預(yù)后STAT3、p-STAT3的表達(dá)的變化，觀察小鼠氣道炎癥的改變及氣道重塑指標(biāo)的變化。
　　 5、使用地塞米松藥物干預(yù)后氣道重塑的改變及IL-21、IL-21R、p-STAT3的表達(dá)變化
　　 用IPP6.0圖像分析軟件分析地塞米松干預(yù)組小鼠氣道壁厚度(WAt/Pbm)

16、、平滑肌厚度(WAm/Pbm)，免疫組化法及western blot法檢測地塞米松組IL-21、IL-21R、p-STAT3蛋白在肺組織中的表達(dá)，采用熒光定量PCR法檢測IL-21mRNA、IL-21RmRNA的表達(dá)。
　　 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)
　　 用(x)±s表示，經(jīng)SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多組樣本均數(shù)兩兩比較，方差齊者用Bonferro

17、ni檢驗(yàn)，方差不齊者用Dunnett's T3法檢驗(yàn);兩變量的相關(guān)分析采用Bivariate過程的等級Pearson相關(guān)法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果：
　　 1、44只小鼠全部存活，OVA致敏激發(fā)后，成功建立了慢性哮喘小鼠模型。對照組小鼠霧化后無明顯異常反應(yīng)，哮喘組小鼠激發(fā)后，出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、二便失禁等癥狀，用聽診器聽診可聞及哮鳴音。地塞米松組及AG490組癥狀相似，但程度明顯減

18、輕。肺組織HE染色鏡下所見符合哮喘的病理學(xué)特征，哮喘組小鼠細(xì)支氣管及伴行血管周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤，氣道壁和肺組織中可見以嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管管壁增厚、管腔狹窄，支氣管管腔內(nèi)可見粘液栓。
　　 2、免疫組化法結(jié)果表明哮喘小鼠同對照組小鼠肺組織均有IL-21、IL-21R的表達(dá)，哮喘組的表達(dá)較對照組表達(dá)增強(qiáng)，與western blot檢測結(jié)果一致;熒光定量PCR法檢測結(jié)果同樣顯示哮喘組小鼠IL-21 mR

19、NA、IL-21RmRNA表達(dá)較對照組增強(qiáng)。反應(yīng)哮喘組小鼠氣道重塑指標(biāo)的WAm/Pbm、WAt/Pbm較對照組增加。
　　 3、哮喘組、AG490組、地塞米松組小鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)均較正常對照組明顯增多;地塞米松治療組與哮喘組相比，細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯減少，AG490組上述指標(biāo)較哮喘組也有所下降;地塞米松組肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒

20、細(xì)胞計(jì)數(shù)低于AG490組。
　　 4、免疫組化及western blot分析顯示對照組幾乎無p-STAT3蛋白表達(dá)，哮喘組小鼠肺組織p-STAT3蛋白表達(dá)較對照組增加，AG490組小鼠肺組織p-STAT3蛋白表達(dá)較哮喘組減弱;熒光定量PCR顯示哮喘組、AG490組小鼠肺組織STAT3 mRNA較對照組增加，兩組相比，無明顯差異。
　　 5、地塞米松組小鼠氣道重構(gòu)指標(biāo)WAm/Pbm、WAt/Pbm高于對照組,低于哮喘組。W

21、estern blot法檢測地塞米松組IL-21、IL-21R、p-STAT3在肺組織中的表達(dá)較哮喘組下降;AG490組小鼠IL-21的表達(dá)較哮喘組下降，與地塞米松組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，AG490組小鼠肺組織p-STAT3的表達(dá)與地塞米松組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;AG490組小鼠肺組織STAT3mRNA的含量較對照增加，但與哮喘組小鼠相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6、相關(guān)性分析結(jié)果:用western blot法測定IL-21蛋白、IL-

22、21R蛋白、p-STAT3蛋白，結(jié)果表明上述指標(biāo)與小鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)均呈正相關(guān);IL-21、IL-21R、p-STAT3的蛋白表達(dá)量與小鼠氣道重構(gòu)指標(biāo)WAm/Pbm、WAt/Pbm均呈正相關(guān)。
　　 研究結(jié)論：
　　 IL-21主要通過JAK-5TAT途徑傳遞信號，本實(shí)驗(yàn)首先用不同實(shí)驗(yàn)方法觀察了IL-21及其受體在正常對照組及哮喘模型組小鼠肺組織中的表達(dá)，觀察了總STAT3及活化后的形式p-STA

23、T3在小鼠肺組織中的表達(dá)，在建立慢性哮喘小鼠動物模型基礎(chǔ)上，使用JAK通路抑制劑AG490及地塞米松干預(yù)后觀察上述指標(biāo)的變化。得出以下結(jié)論:
　　 1、IL-21及其受體在小鼠肺組織中有表達(dá)，哮喘小鼠肺組織的表達(dá)較對照組增高，IL-21在哮喘發(fā)病中是重要的促炎因子，IL-21與受體結(jié)合參與慢性哮喘小鼠發(fā)病，并參與了氣道重塑過程;
　　 2、STAT3及活化后的STAT3參與了哮喘發(fā)病，可能影響了氣道重塑;