LEPTIN、STAT3和IL-6在哮喘大鼠氣道上皮細(xì)胞的表達(dá)及Dexamethasone和Montelukast的調(diào)控研究.pdf

1、目的: 支氣管哮喘(哮喘)是一種由多種炎癥細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的慢性氣道變應(yīng)性炎癥性疾病，其炎癥細(xì)胞與其自身分泌的細(xì)胞因子互相影響，構(gòu)成了龐大的、錯綜復(fù)雜且效應(yīng)廣泛的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，從而構(gòu)成哮喘慢性炎癥持續(xù)和發(fā)展的病理生理基礎(chǔ)。目前，哮喘的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但主要與氣道的過度免疫反應(yīng)有關(guān)。 在免疫系統(tǒng)中，leptin可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的增殖和活化，促進(jìn)細(xì)胞因子如:IL-6，IL-Iβ、TNF-a的合成，促使免疫反應(yīng)向Th1方

2、向漂移與炎癥反應(yīng)，促進(jìn)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)和NK細(xì)胞的活化增殖。近來許多研究表明:leptin和哮喘有密切的關(guān)系，leptin與其配體結(jié)合后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主要通過jak-stat3途徑來完成。1eptin通過Jak/Stat途徑，激活Stat3而誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，促進(jìn)下游細(xì)胞因子的合成，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)。 本次實(shí)驗(yàn)通過研究LEPTIN、STAT3及IL-6在哮喘大鼠肺組織的表達(dá)，及其與氣道炎癥的關(guān)系和影響，探討糖皮質(zhì)激素和白三烯受

3、體拮抗劑對leptin，stat3和IL-6的影響和對氣道炎癥的調(diào)控作用。 方法: 1.大鼠的分組與免疫:SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組(A組)、支氣管哮喘組(B組)、Dexamethasone治療組(C組)和Montelukast治療組(D組)，每組8只。用新鮮配制的OVA混懸液1ml(100mgOVA和100mg氧氧化鋁干粉加入1ml生理鹽水制成)，分別于第一天腹腔注射1ml致敏，于第15天起超聲霧化吸人1％的OVA.生

4、理鹽水激發(fā)，每天二十分鐘，一共7天，建立支氣管哮喘動物模型。Dexamethasone組在激發(fā)哮喘前半小時腹腔注射Dexamethasone 0.2mg/只，Montelukast組在激發(fā)哮喘前1.5小時用Montelukast溶于蒸餾水中灌胃1mg/只，哮喘組在動物致敏激發(fā)支氣管哮喘前，不給予任何藥物處理。實(shí)驗(yàn)對照組動物第一天用生理鹽水1ml腹腔注射，然后第15天起超聲霧化吸人生理鹽水激發(fā)，每天二十分鐘，一共7天。 2.支氣管

5、肺泡灌洗，進(jìn)行細(xì)胞分類、計數(shù):通過支氣管肺泡灌洗觀察大鼠氣道炎癥細(xì)胞的浸潤情況。暴露大鼠氣管并插入套管，用2ml生理鹽水逐漸滴入到肺內(nèi)，反復(fù)抽吸3次，回收支氣管肺泡灌洗液(BALF)約5ml，測定BAIF中細(xì)胞總數(shù)及分類。 3.組織學(xué)檢查:取右肺中葉組織，10％甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片。觀察肺組織大體形態(tài)，使用HE染色法觀察細(xì)胞浸潤情況。 4.肺組織1eptin、STAT3、IL-6免疫組織化學(xué)染色，其操作步驟按

6、說明書進(jìn)行。 結(jié)果: 1.哮喘大鼠模型的建立:①實(shí)驗(yàn)過程中觀察:實(shí)驗(yàn)中哮喘大鼠激發(fā)后煩躁不安，呼吸急促，抓鼻，噴嚏，嚴(yán)重者口鼻、爪子輕度紫紺，行動遲緩或俯伏不動。②哮喘大鼠BALF白細(xì)胞分類計數(shù)以及嗜酸性粒細(xì)胞較正常大鼠明顯增加。③支氣管-肺組織HE染色示:哮喘組大鼠肺組織切片可見支氣管和血管周圍及其管腔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，以嗜酸性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞滲出為主；支氣管粘膜上皮水腫、變性和脫落；毛細(xì)血管擴(kuò)張，充血，細(xì)小的支氣管內(nèi)可

7、見粘液栓，細(xì)支氣管和小血管的管壁輕度增厚，肺泡腔融合擴(kuò)大，周圍組織水腫。以上特點(diǎn)表明大鼠哮喘模型復(fù)制成功。 2.病理組織學(xué)改變特點(diǎn):正常組大鼠肺組織切片未見或偶見極輕度的病理損傷；周圍血管和支氣管偶見極少量炎性細(xì)胞，但未見嗜酸性粒細(xì)胞；肺泡結(jié)構(gòu)完整；周圍組織無水腫，氣道上皮細(xì)胞無損傷。哮喘組大鼠肺組織切片可見支氣管和血管周圍及其管腔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，以嗜酸性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞滲出為主；支氣管粘膜上皮水腫、變性和脫落；毛細(xì)血管擴(kuò)張，充

8、血，細(xì)小的支氣管內(nèi)可見粘液栓，細(xì)支氣管和小血管的管壁輕度增厚，肺泡腔融合擴(kuò)大，周圍組織水腫。Dexamethasone組大鼠肺組織切片顯示炎癥明顯好轉(zhuǎn)，支氣管及血管周圍及管腔內(nèi)可見輕度炎性細(xì)胞浸潤，偶見少許嗜酸性粒細(xì)胞浸潤；支氣管粘膜上皮基本完整，粘膜輕度水腫。Montelukast組支氣管及血管周圍及管腔內(nèi)可見輕-中度炎性細(xì)胞浸潤，嗜酸性粒細(xì)胞少見，支氣管粘膜上皮有輕-中度損傷，中度肺泡及細(xì)支氣管水腫。 3.BALF中白細(xì)胞的

9、數(shù)量和分類計數(shù)的水平:通過形態(tài)測定分析，哮喘組大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)(62.31±3.16)，嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)(6.52±1.29)以及淋巴細(xì)胞(8.38±1.21)和中性粒細(xì)胞(7.57±1.18)數(shù)量較正常對照組白細(xì)胞總數(shù)(23.31±1.81)，嗜酸性粒細(xì)胞(0.48±0.30)以及淋巴細(xì)胞(0.94±0.19)和中性粒細(xì)胞(0.91±0.21)明顯增多，Dexamethasone組白細(xì)胞總數(shù)(39.50±4.44)，嗜酸

10、性粒細(xì)胞(1.48±0.37)以及淋巴細(xì)胞(2.70±0.56)和中性粒細(xì)胞(4.99±0.94)和Montelukast組自細(xì)胞總數(shù)(44.54±1.33)，嗜酸性粒細(xì)胞(1.76±0.35)以及淋巴細(xì)胞(3.03±0.48)和中性粒細(xì)胞(3.01±0.55)較哮喘組明顯減少，它們之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。 4.leptin在肺組織的表達(dá):用免疫組化方法發(fā)現(xiàn)leptin在支氣管上皮細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞呈陽性表達(dá)，正

11、常對照組有少量在支氣管上皮表達(dá)，哮喘組表達(dá)明顯增多，Dexamethasone組和Montelukast組表達(dá)都比哮喘組更加增強(qiáng)。哮喘組(5.22±0.58)和正常組(2.98±0.51)之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；Dexamethasone組(5.61±0.27)和Montelukast組(5.43±0.36)與哮喘組(5.22±0.58)之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。STAT3在肺組織的表達(dá):STAT3

12、在氣道上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞呈陽性表達(dá)，正常對照組有少量在支氣管上皮表達(dá)，哮喘組表達(dá)明顯增多，Dexamethasone組和Montelukast組表達(dá)都減少。哮喘組(4.67±0.69)和正常組(2.52±0.33)之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；Dexamethasone組(2.95±0.48)和Montelukast組(3.05±0.53)與哮喘組(4.67±0.69)之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

13、IL-6在肺組織的表達(dá):IL-6在巨噬細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，支氣管黏膜上皮細(xì)胞呈陽性表達(dá)，正常對照組有少量在支氣管上皮表達(dá)，哮喘組表達(dá)明顯增多，Dexamethasone組和Montelukast組表達(dá)都減少。哮喘組(5.32±0.56)和正常組(2.87±0.54)之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；Dexamethasone組(3.26±0.74)和Montelukast組(3.40±0.74)與哮喘組之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

14、P<0.01)。 5.Dexamethasone組和Montelukast組相比較，leptin，STAT3和IL-6表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)。 6.Person相關(guān)性分析:在正常對照組，leptin，STAT3和IL-6表達(dá)較少，故未做相關(guān)性分析；在哮喘組，LEPTIN和STAT3(r=0.566，P=0.000)，STAT3和IL-6(r=0.525，P=0.001)在大鼠肺組織中的表達(dá)呈線性正相關(guān)；在D

15、examethasone組，LEPTIN和STAT3在大鼠肺組織中的表達(dá)無相關(guān)性，STAT3和IL-6(r=0.668，P=0.000)在大鼠肺組織中的表達(dá)呈線性正相關(guān)；在Montelukast組，LEPTIN和STAT3在大鼠肺組織中的表達(dá)無相關(guān)性，STAT3和IL-6(r=0.853，P=0.000)在大鼠肺組織中的表達(dá)呈線性正相關(guān)。 結(jié)論: 1.哮喘大鼠leptin，stat3和IL-6在氣道上皮表達(dá)明顯增多，且呈