IL-6和STAT-3在胃癌中表達(dá)關(guān)系及雙膦酸鹽藥物抑癌機(jī)制的研究.pdf

1、目的：在我國(guó)，胃癌是嚴(yán)重威脅人們健康的疾病。在腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移過(guò)程中，腫瘤抗原刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生和分泌較多的內(nèi)源性IL-6(interleukin-6，IL-6)，IL-6在腫瘤細(xì)胞中的過(guò)量表達(dá)又可以促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖和分化，即內(nèi)源性的IL-6水平升高與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。 IL-6 的信號(hào)主要通過(guò)JAK/STATs途徑與P21ras/MARK/NF-IL6途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)至核內(nèi)。在JAK/STATs途徑中，IL-6主要激活

2、信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal Transducer and Activator of Transcription，STAT-3)，STAT-3與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。多項(xiàng)研究表明，STAT-13通過(guò)磷酸化激活后，可導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖和凋亡障礙，促進(jìn)腫瘤的形成和發(fā)展。IL-6信號(hào)的傳導(dǎo)是通過(guò)JAK激酶的介導(dǎo)作用使STAT-3發(fā)生酪氨酸磷酸化反應(yīng)而活化[6]。從而形成STAT-3/3同二聚體而轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，與II型IL-6反

3、應(yīng)成分(II-6reactive elemen，tIL-6RE)結(jié)合并誘導(dǎo)某些反應(yīng)基因的表達(dá)。因此，在人胃癌細(xì)胞株中進(jìn)行有關(guān)IL-6與p-STAT-3信號(hào)傳導(dǎo)功能關(guān)系的研究，有助于闡明JAK/STAT信號(hào)途徑在胃癌發(fā)病機(jī)制中所起的重要作用。 雙膦酸鹽類(lèi)藥物(Bisphosphonates，BPs)是用于各類(lèi)骨疾患及鈣代謝性疾病的一類(lèi)新藥物，最近有研究發(fā)現(xiàn)BPs能抑制多種癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)，主要通過(guò)抑制羥戊酸旁路的關(guān)鍵酶-焦磷酸法尼酯

4、合酶，減少蛋白質(zhì)異戊烯化及胞內(nèi)的信號(hào)蛋白的激活，同時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞增殖。為探討IL-6、STAT-3與胃癌發(fā)生的關(guān)系及BPs的作用機(jī)制，本研究采用免疫組織化學(xué)，Western blot方法分別檢測(cè)了42例臨床手術(shù)切除胃癌及相應(yīng)對(duì)照組織IL-6、p-STAT-3蛋白表達(dá)。同時(shí)采用流式細(xì)胞術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)染色、Westernblot等方法研究分析，雙磷酸鹽類(lèi)藥物對(duì)體外培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞株IL-6、p-STAT-3蛋白表達(dá)的影響。為進(jìn)一步探討B(tài)P

5、s的抗腫瘤作用機(jī)制及指導(dǎo)臨床用藥治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料與方法： 1.材料 1.1 收集河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院胃腸外科2006年1月-2007年12月42例手術(shù)切除新鮮胃癌組織及相應(yīng)遠(yuǎn)殘端黏膜部位胃組織(距腫瘤＞10cm)作為對(duì)照，所有癌組織均經(jīng)病理醫(yī)師確定診斷證實(shí)，術(shù)前均未接受放療或化療。 1.2 人胃癌細(xì)胞株SGC-7901。 1.3雙膦酸鹽類(lèi)藥物(BPs)： IB(伊班膦酸鈉)；

6、 代號(hào)：Cp化合物(含氮磷鍵的雙膦酸化合物，化學(xué)名稱(chēng)為[2-(6-氨基-嘌呤-9-基)-1-羥基.膦酰乙基]膦酸，后均簡(jiǎn)稱(chēng)Cp)。 2.方法 2.1 應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)(SP法)檢測(cè)胃癌及對(duì)照組織中IL-6、p-STAT-3蛋白的表達(dá)。 2.2 分別提取胃癌及對(duì)照組織總蛋白采用蛋白印跡法(Western blot)檢測(cè)胃癌及對(duì)照組織IL-6、p-STAT-3蛋白表達(dá)。 2.3 甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法

7、測(cè)定各組SGC-7901細(xì)胞株的增殖情況，以確定半數(shù)抑制濃度(IC50)。設(shè)立空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、藥物實(shí)驗(yàn)組；藥物濃度：IB：90、 120、150、180、210mol/L； CP：90、 120、150、180、210mol/L。分別于藥物作用72 h后測(cè)定IOD值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，根據(jù)IC50=Lg-1(Xm-μ∑P-0.5))，確定IC50(IB：220μmol/L， CP：150μmol/L)。 2.4 兩種藥

8、物以IC50濃度分別作用細(xì)胞72h后收集細(xì)胞。流式細(xì)胞定量檢測(cè)技術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化。 2.5分別選取兩種藥物的三個(gè)不同濃度，IB：160ktmol/L、220/μmol/L、280μmol/L；CP：90μmol/L、150μmol/L、210μmol/L作用于SGC-7901細(xì)胞株，F(xiàn)CM檢測(cè)藥物作用24h、48h、72h后細(xì)胞周期的變化。 2.6 蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測(cè)兩種藥物以I

9、C50濃度分別作用24h、48h、72 h，細(xì)胞中IL-6，p-STAT-3蛋白的表達(dá)情況。 2.7 免疫細(xì)胞化學(xué)法(sP法)觀察藥物作用72 h細(xì)胞IL-6、p-STAT-3蛋白表達(dá)情況的變化。 結(jié)果： 1.免疫組織化學(xué)結(jié)果IL-6主要為胞漿著棕黃色，p-STAT-3胞漿和胞核均著棕黃色。在42例對(duì)照組織中IL-6陽(yáng)性表達(dá)率為9.62％(3/42)，p-STAT-3未見(jiàn)表達(dá)。在42例胃癌組織中IL-6和p-ST

10、AT-3表達(dá)的陽(yáng)性率為73.81％(31/42)和35.71％(15/42)明顯高于對(duì)照組織（P＜0.05)。IL-6，p-STAT-3兩種蛋白表達(dá)水平之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系(X2=10.227 P＜0.05)，癌組織中IL-6蛋白表達(dá)分別與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度有顯著相關(guān)性(P＜0.05)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或侵入漿膜的胃癌組織中，IL-6的表達(dá)陽(yáng)性率明顯增高；而與患者性別、腫瘤組織學(xué)類(lèi)型、腫瘤分化程度無(wú)相關(guān)性(P＞0.05)；p-STAT-3

11、蛋白表達(dá)分別與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度有顯著相關(guān)性(P＜0.05)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或分化程度低的胃癌組織中p-STAT-3蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯增高，而與患者性別、腫瘤組織學(xué)類(lèi)型、浸潤(rùn)深度無(wú)相關(guān)性(P＞0.05)。 2.Western Blot檢測(cè)結(jié)果β-actin、IL-6、p-STAT3蛋白分子量為42KD、26kD、90kD，Western雜交后在相應(yīng)位置出現(xiàn)陽(yáng)性條帶。采用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)雜交條帶進(jìn)行半定量分析，蛋白含量以積分

12、光密度值(IOD)表示。每次檢測(cè)蛋白時(shí)均以β-actin蛋白為內(nèi)參，以相對(duì)積分光密度比較蛋白表達(dá)高低。與對(duì)照組織相比，42例有33例出現(xiàn)胃癌組織中IL-6蛋白高表達(dá)，其高表達(dá)率為78.57％，有27例出現(xiàn)p-STAT3蛋白高表達(dá)，其高表達(dá)率為64.28％。 3.IB、CP對(duì)SGC-7901細(xì)胞株增殖的影響兩種藥物均可抑制SGC-7901細(xì)胞增殖，藥物濃度和作用時(shí)間不同其抑制作用不同。隨著藥物濃度增加，作用時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用逐漸增

13、強(qiáng)，210μmol/L的CP和IB作用72 h的抑制率分別達(dá)76.43％、51.71％。溶劑對(duì)照組與空白對(duì)照組細(xì)胞未見(jiàn)明顯變化(P＞0.05)。IB的IC50為220μmol/L，CP的IC50為150μmol/L。 4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果兩種藥物均可誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞株凋亡，藥物實(shí)驗(yàn)組SGC-7901細(xì)胞DNA直方圖二倍體峰前均可見(jiàn)凋亡細(xì)胞特征性的亞二倍體峰(Fig.1-3)，對(duì)照組未見(jiàn)凋亡峰。IB組與CP組凋亡率均高于

14、對(duì)照組(P＜0.05)，提示BPs可促進(jìn)胃癌細(xì)胞株凋亡，兩種藥物組之間細(xì)胞的凋亡率無(wú)顯著差異(P＞0.05)。兩種藥物對(duì)于細(xì)胞周期的影響均顯著大于對(duì)照組(P＜0.05)，隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，藥物濃度的增加，S期細(xì)胞數(shù)逐漸增加，G0/G1期和G2/M期細(xì)胞數(shù)逐漸減少。CP組作用強(qiáng)于IB組(P＜0.05，Table 3)。由此可見(jiàn)，BPs可以將細(xì)胞阻滯于S期，且有明顯的量效和時(shí)效關(guān)系。 5 免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果光鏡下觀察IB、CP作

15、用于SGC-7901細(xì)胞72h后，IL-6、p-STAT-3蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較均降低CP作用強(qiáng)于IB。 6 Western Blot檢測(cè)結(jié)果隨著B(niǎo)Ps作用時(shí)間延長(zhǎng)IL-6，p-STAT-3蛋白表達(dá)量逐漸降低，藥物作用時(shí)間與表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.627，r=-0.738，P＜0.05)。CP組作用強(qiáng)于IB組，兩者與對(duì)照組比較，均有顯著性差異(P＜0.05)。 結(jié)論: 1.在胃癌組織中IL-6、p-STAT-3

16、呈現(xiàn)高表達(dá)，兩者之間有顯著正相關(guān)關(guān)系，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或侵入漿膜的胃癌組織中，IL-6蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯增高；在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或分化程度低的胃癌組織中p-STAT-3蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯增高。 2.雙膦酸鹽類(lèi)藥物抗腫瘤作用機(jī)制為通過(guò)調(diào)節(jié)IL-6使STAT-3蛋白活化受抑制，降低磷酸化STAT-3蛋白表達(dá)，從而減低p-STAT-3細(xì)胞的促進(jìn)增殖和抑制凋亡的作用，進(jìn)而抑制腫瘤。 3.雙膦酸鹽類(lèi)藥物可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，還可通過(guò)延長(zhǎng)細(xì)胞周