IL-6和STAT-3在胃癌中表達關系及雙膦酸鹽藥物抑癌機制的研究.pdf

1、目的：在我國，胃癌是嚴重威脅人們健康的疾病。在腫瘤細胞增殖、浸潤或轉移過程中，腫瘤抗原刺激免疫細胞產生和分泌較多的內源性IL-6(interleukin-6，IL-6)，IL-6在腫瘤細胞中的過量表達又可以促進多種細胞的增殖和分化，即內源性的IL-6水平升高與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。 IL-6 的信號主要通過JAK/STATs途徑與P21ras/MARK/NF-IL6途徑轉導至核內。在JAK/STATs途徑中，IL-6主要激活

2、信號傳導與轉錄激活因子3(Signal Transducer and Activator of Transcription，STAT-3)，STAT-3與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。多項研究表明，STAT-13通過磷酸化激活后，可導致細胞的異常增殖和凋亡障礙，促進腫瘤的形成和發(fā)展。IL-6信號的傳導是通過JAK激酶的介導作用使STAT-3發(fā)生酪氨酸磷酸化反應而活化[6]。從而形成STAT-3/3同二聚體而轉入細胞核，與II型IL-6反

3、應成分(II-6reactive elemen，tIL-6RE)結合并誘導某些反應基因的表達。因此，在人胃癌細胞株中進行有關IL-6與p-STAT-3信號傳導功能關系的研究，有助于闡明JAK/STAT信號途徑在胃癌發(fā)病機制中所起的重要作用。 雙膦酸鹽類藥物(Bisphosphonates，BPs)是用于各類骨疾患及鈣代謝性疾病的一類新藥物，最近有研究發(fā)現BPs能抑制多種癌細胞系的生長，主要通過抑制羥戊酸旁路的關鍵酶-焦磷酸法尼酯

4、合酶，減少蛋白質異戊烯化及胞內的信號蛋白的激活，同時抑制腫瘤細胞增殖。為探討IL-6、STAT-3與胃癌發(fā)生的關系及BPs的作用機制，本研究采用免疫組織化學，Western blot方法分別檢測了42例臨床手術切除胃癌及相應對照組織IL-6、p-STAT-3蛋白表達。同時采用流式細胞術、免疫細胞化學染色、Westernblot等方法研究分析，雙磷酸鹽類藥物對體外培養(yǎng)的人胃癌細胞株IL-6、p-STAT-3蛋白表達的影響。為進一步探討B(tài)P

5、s的抗腫瘤作用機制及指導臨床用藥治療提供實驗依據。 材料與方法： 1.材料 1.1 收集河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院胃腸外科2006年1月-2007年12月42例手術切除新鮮胃癌組織及相應遠殘端黏膜部位胃組織(距腫瘤＞10cm)作為對照，所有癌組織均經病理醫(yī)師確定診斷證實，術前均未接受放療或化療。 1.2 人胃癌細胞株SGC-7901。 1.3雙膦酸鹽類藥物(BPs)： IB(伊班膦酸鈉)；

6、 代號：Cp化合物(含氮磷鍵的雙膦酸化合物，化學名稱為[2-(6-氨基-嘌呤-9-基)-1-羥基.膦酰乙基]膦酸，后均簡稱Cp)。 2.方法 2.1 應用免疫組織化學技術(SP法)檢測胃癌及對照組織中IL-6、p-STAT-3蛋白的表達。 2.2 分別提取胃癌及對照組織總蛋白采用蛋白印跡法(Western blot)檢測胃癌及對照組織IL-6、p-STAT-3蛋白表達。 2.3 甲基偶氮唑藍(MTT)法

7、測定各組SGC-7901細胞株的增殖情況，以確定半數抑制濃度(IC50)。設立空白對照組、溶劑對照組、藥物實驗組；藥物濃度：IB：90、 120、150、180、210mol/L； CP：90、 120、150、180、210mol/L。分別于藥物作用72 h后測定IOD值，計算細胞生長抑制率，根據IC50=Lg-1(Xm-μ∑P-0.5))，確定IC50(IB：220μmol/L， CP：150μmol/L)。 2.4 兩種藥

8、物以IC50濃度分別作用細胞72h后收集細胞。流式細胞定量檢測技術(FCM)檢測細胞凋亡率的變化。 2.5分別選取兩種藥物的三個不同濃度，IB：160ktmol/L、220/μmol/L、280μmol/L；CP：90μmol/L、150μmol/L、210μmol/L作用于SGC-7901細胞株，FCM檢測藥物作用24h、48h、72h后細胞周期的變化。 2.6 蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測兩種藥物以I

9、C50濃度分別作用24h、48h、72 h，細胞中IL-6，p-STAT-3蛋白的表達情況。 2.7 免疫細胞化學法(sP法)觀察藥物作用72 h細胞IL-6、p-STAT-3蛋白表達情況的變化。 結果： 1.免疫組織化學結果IL-6主要為胞漿著棕黃色，p-STAT-3胞漿和胞核均著棕黃色。在42例對照組織中IL-6陽性表達率為9.62％(3/42)，p-STAT-3未見表達。在42例胃癌組織中IL-6和p-ST

10、AT-3表達的陽性率為73.81％(31/42)和35.71％(15/42)明顯高于對照組織（P＜0.05)。IL-6，p-STAT-3兩種蛋白表達水平之間呈顯著正相關關系(X2=10.227 P＜0.05)，癌組織中IL-6蛋白表達分別與淋巴結轉移、浸潤深度有顯著相關性(P＜0.05)，在淋巴結轉移或侵入漿膜的胃癌組織中，IL-6的表達陽性率明顯增高；而與患者性別、腫瘤組織學類型、腫瘤分化程度無相關性(P＞0.05)；p-STAT-3

11、蛋白表達分別與淋巴結轉移、腫瘤分化程度有顯著相關性(P＜0.05)，在淋巴結轉移或分化程度低的胃癌組織中p-STAT-3蛋白表達陽性率明顯增高，而與患者性別、腫瘤組織學類型、浸潤深度無相關性(P＞0.05)。 2.Western Blot檢測結果β-actin、IL-6、p-STAT3蛋白分子量為42KD、26kD、90kD，Western雜交后在相應位置出現陽性條帶。采用凝膠成像分析系統(tǒng)對雜交條帶進行半定量分析，蛋白含量以積分

12、光密度值(IOD)表示。每次檢測蛋白時均以β-actin蛋白為內參，以相對積分光密度比較蛋白表達高低。與對照組織相比，42例有33例出現胃癌組織中IL-6蛋白高表達，其高表達率為78.57％，有27例出現p-STAT3蛋白高表達，其高表達率為64.28％。 3.IB、CP對SGC-7901細胞株增殖的影響兩種藥物均可抑制SGC-7901細胞增殖，藥物濃度和作用時間不同其抑制作用不同。隨著藥物濃度增加，作用時間延長，抑制作用逐漸增

13、強，210μmol/L的CP和IB作用72 h的抑制率分別達76.43％、51.71％。溶劑對照組與空白對照組細胞未見明顯變化(P＞0.05)。IB的IC50為220μmol/L，CP的IC50為150μmol/L。 4 流式細胞術檢測結果兩種藥物均可誘導SGC-7901細胞株凋亡，藥物實驗組SGC-7901細胞DNA直方圖二倍體峰前均可見凋亡細胞特征性的亞二倍體峰(Fig.1-3)，對照組未見凋亡峰。IB組與CP組凋亡率均高于

14、對照組(P＜0.05)，提示BPs可促進胃癌細胞株凋亡，兩種藥物組之間細胞的凋亡率無顯著差異(P＞0.05)。兩種藥物對于細胞周期的影響均顯著大于對照組(P＜0.05)，隨著藥物作用時間的延長，藥物濃度的增加，S期細胞數逐漸增加，G0/G1期和G2/M期細胞數逐漸減少。CP組作用強于IB組(P＜0.05，Table 3)。由此可見，BPs可以將細胞阻滯于S期，且有明顯的量效和時效關系。 5 免疫細胞化學結果光鏡下觀察IB、CP作

15、用于SGC-7901細胞72h后，IL-6、p-STAT-3蛋白表達與對照組比較均降低CP作用強于IB。 6 Western Blot檢測結果隨著BPs作用時間延長IL-6，p-STAT-3蛋白表達量逐漸降低，藥物作用時間與表達量呈負相關(r=-0.627，r=-0.738，P＜0.05)。CP組作用強于IB組，兩者與對照組比較，均有顯著性差異(P＜0.05)。 結論: 1.在胃癌組織中IL-6、p-STAT-3

16、呈現高表達，兩者之間有顯著正相關關系，在淋巴結轉移或侵入漿膜的胃癌組織中，IL-6蛋白表達陽性率明顯增高；在淋巴結轉移或分化程度低的胃癌組織中p-STAT-3蛋白表達陽性率明顯增高。 2.雙膦酸鹽類藥物抗腫瘤作用機制為通過調節(jié)IL-6使STAT-3蛋白活化受抑制，降低磷酸化STAT-3蛋白表達，從而減低p-STAT-3細胞的促進增殖和抑制凋亡的作用，進而抑制腫瘤。 3.雙膦酸鹽類藥物可誘導腫瘤細胞凋亡，還可通過延長細胞周