IL--6在垂體瘤細(xì)胞衰老中表達(dá)調(diào)控和作用機(jī)制研究.pdf

1、最近研究表明，白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）在癌基因誘導(dǎo)衰老方面起關(guān)鍵作用(oncogene-induced-senescense，OIS)。旁分泌的IL-6可以誘導(dǎo)初始細(xì)胞增殖，自分泌的IL-6可導(dǎo)致細(xì)胞衰老，限制細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和侵襲性增長，在垂體腺瘤發(fā)生與發(fā)展中起至關(guān)重要的作用。IL-6參與垂體腺瘤的衰老與增殖。我們的研究旨在比較參與過早熟衰老途徑中正常、老化、垂體腺瘤細(xì)胞中相關(guān)蛋白和細(xì)胞因子的表達(dá)。掌握垂體腺

2、瘤的衰老調(diào)控，合理應(yīng)用細(xì)胞衰老阻止靜默生長腫瘤增殖和惡變。
　　第一部分構(gòu)建F344大鼠亞急性泌乳素腺瘤衰老模型并評估其研究有效性
　　目的:構(gòu)建泌乳素腺瘤亞急性衰老模型，評估此法構(gòu)建的亞急性垂體瘤模型對衰老研究的可行性及有效性。
　　方法:15只Fischer344雌性大鼠被隨機(jī)分為三組，每組5只。分為A:正常對照組;B:雌激素誘導(dǎo)的垂體腺瘤組;C:D-半乳糖誘導(dǎo)亞急性衰老垂體腺瘤組。誘導(dǎo)垂體衰老使用連續(xù)D-gala

3、ctose（D-gal）腹腔注射，泌乳素腺瘤生成是通過含有雌激素(DES)緩釋硅膠管植入。正常對照組:生理鹽水硅膠管皮下埋植，術(shù)后7d腹腔內(nèi)注射生理鹽水;B組垂體腺瘤:10mgE2緩釋管皮下埋置+術(shù)后7d腹腔內(nèi)注射生理鹽水;C組亞急性衰老垂體腺瘤組:10 mgE2+建模7d后腹腔內(nèi)注射D-半乳糖，200mg/kg/d。對照組注射等量的生理鹽水。連續(xù)注射到術(shù)后8w處死所有的大鼠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理的標(biāo)準(zhǔn)參照NIH實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指南，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)被蘇州大學(xué)

4、倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，
　　觀察垂體形狀、大小、質(zhì)地和顏色，與視神經(jīng)及頸內(nèi)動(dòng)脈比鄰關(guān)系，觀察鞍底形狀，是否增大，骨質(zhì)是否破壞。Y迷宮測試大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力的變化。觀察大鼠的、體型、體重、皮毛、精神狀態(tài)、尿量和對外界刺激的反應(yīng)能力，綜合評估模型的有效性。垂體和大鼠體重進(jìn)行記錄和分析。對垂體組織用PRL antibody進(jìn)行免疫組化染色，β-Galactosidase酶活性試劑盒檢測衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色。
　　結(jié)果:(1)D-

5、半乳糖誘導(dǎo)亞急性衰老垂體腺瘤組大鼠體重增加緩慢，尿量增加、尿比重下降。反應(yīng)能力和學(xué)習(xí)與記憶能力下降，出現(xiàn)衰老特征;(2)與對照組相比，接受DES誘導(dǎo)的B、C組垂體重量增加5倍，(p＜0.01)，B組垂體瘤最重。解剖顯示腫瘤壓迫視神經(jīng)、頸內(nèi)動(dòng)脈，造成鞍底擴(kuò)大，骨質(zhì)變薄，表明腫瘤具有侵襲性。HE染色B，C組既有腫瘤生長特點(diǎn)又有衰老特征。垂體細(xì)胞核大小不一，深染，有異型性。呈腫瘤樣改變。腫瘤血管增生呈片狀，也稱作血管湖樣區(qū)域。C組有空泡樣細(xì)胞

6、產(chǎn)生，細(xì)胞膜皺縮，同B組相比，腫瘤細(xì)胞相對較小，變形，部分可見脂褐素樣顆粒。對照組垂體免疫組織化學(xué)表達(dá)PRL陽性細(xì)胞比例不到5％，B組視野下超過90％的細(xì)胞質(zhì)中PRL呈強(qiáng)陽性，C組70％細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá);(3)B組PRL分泌顯著增加，C組中泌乳素水平明顯降低;(4)冰凍切片和免疫組織化染色顯示β-Galactosidase酶染色陽性顆粒在C組顯著增加，在B組極低，A組基本無表達(dá)。
　　結(jié)論:雌激素聯(lián)合D-半乳糖能夠成功誘導(dǎo)F344

7、大鼠產(chǎn)生亞急性PRL腺瘤。動(dòng)物模型經(jīng)檢測，在成功生成泌乳素腺瘤的同時(shí)也出現(xiàn)明顯的垂體瘤細(xì)胞衰老特征。
　　第二部分垂體瘤轉(zhuǎn)化基因(PTTG)同衰老相關(guān)蛋白在垂體衰老和垂體瘤進(jìn)展中關(guān)聯(lián)性研究
　　目的:闡明癌基因誘導(dǎo)衰老在垂體瘤發(fā)生過程中的作用。
　　方法:18只雌性大鼠隨機(jī)分為3組，每組6只大鼠。正常對照組（control），D-半乳糖誘導(dǎo)衰老組(aging);E2垂體腺瘤組(tumor)。造模方法同前。觀察大鼠的一般

8、生命體征和衰老表型。對垂體進(jìn)行HE及免疫組化染色。Real-time PCR測量垂體內(nèi)PTTG、p53、p21、p16 mRNA表達(dá)，觀察蛋白表達(dá)相互關(guān)系。Western-blot檢測p16、p21、PTTG在垂體組織中表達(dá)。
　　結(jié)果:(1) aging組大鼠出現(xiàn)明顯衰老的征，包括脫毛，體重下降，尿量減少，Tumor組大鼠尿量明顯增加，aging組大鼠4周后體重減輕。衰老組垂體明顯小于正常對照組垂體，垂體萎縮，質(zhì)地韌，似空蝶鞍表

9、現(xiàn)。垂體腺瘤組垂體重量超出正常組3倍，P＜0.01，有顯著差異。衰老組大鼠的體重略小于正常組大鼠，沒有明顯的差異。衰老組大鼠垂體重量比腫瘤組大鼠小，P＜0.01有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;(2)衰老組大鼠垂體病理切片可見垂體腺管狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，沒有明顯的血管增生。胞質(zhì)內(nèi)有空泡，異染色質(zhì)存在于細(xì)胞中。在衰老組大鼠垂體中，PRL免疫組化陰性，垂體腺瘤組為強(qiáng)陽性;(3)腫瘤組大鼠垂體組織中PTTG mRNA表達(dá)水平明顯高于對照組和衰老組。衰老組

10、中PTTG mRNA表達(dá)水平明顯下降，為三組最低，組間有顯著差異，P＜0.05。衰老組p53、p16、p21基因表達(dá)明顯高于對照組和腫瘤組，三者表達(dá)在腫瘤組明顯降低;(4)采用Western-blot半定量分析顯示目的基因的蛋白表達(dá)水平。垂體瘤組內(nèi)PTTG表達(dá)明顯增加。p16、p21在衰老組為高表達(dá)，在垂體腺瘤組表達(dá)減弱。
　　結(jié)論:
　　1.p16、p21是垂體細(xì)胞衰老重要的調(diào)控因子
　　2.PTTG表達(dá)減弱導(dǎo)致垂體

11、細(xì)胞非整倍體形成、DNA損傷，進(jìn)而激活衰老通路。PTTG基因過表達(dá)引起繞過OIS，導(dǎo)致腫瘤形成。
　　3.雌激素能增加PTTG表達(dá)，產(chǎn)生PRL腺瘤，垂體細(xì)胞衰老導(dǎo)致PTTG水平下降。抑制PTTG表達(dá)以及雌激素結(jié)合受體轉(zhuǎn)錄，可以誘導(dǎo)衰老的信號通路激活。
　　第三部分 IL-6在垂體瘤細(xì)胞衰老中表達(dá)調(diào)控和作用機(jī)制研究
　　目的:研究旨在比較參與過早熟衰老途徑中，正常、老化、垂體腺瘤細(xì)胞中相關(guān)蛋白和細(xì)胞因子的表達(dá)。能夠很好的

12、掌握垂體腺瘤的衰老調(diào)控，合理應(yīng)用阻止靜默生長腫瘤增殖和惡變。
　　方法:27只F344雌性大鼠被分成5組，對照組3只，其余各組6只。對照組(A);垂體衰老組(B);垂體腫瘤組(C);垂體瘤+早期衰老組(D);垂體腫瘤+中期誘導(dǎo)衰老組(E)。衰老組8周內(nèi)每日D-半乳糖20mg/kg/d，術(shù)后腹腔內(nèi)注射，早期衰老干預(yù)組垂體腫瘤衰老組注射49天，術(shù)后七天內(nèi)開始，而中期衰老干預(yù)組注射42d，術(shù)后7d內(nèi)開始。所有大鼠8周后斷頭處死。其余組注

13、射生理鹽水比較，處死前內(nèi)眥靜脈采血。鼠白介素-6酶聯(lián)免疫試劑盒(CUSABIO)檢測血漿IL-6水平。觀察大鼠的一般生命體征和衰老表型。垂體組織行HE染色和PRL免疫組化染色。提取垂體RNA，Real-time PCR檢測垂體內(nèi)PTTG、p53、p21、p16、IL-6、C/EBPβ mRNA表達(dá)，Western-blot檢測p16、p21、IL-6在垂體組織中表達(dá)。
　　結(jié)果:中期誘導(dǎo)衰老組尿量顯著增加，相對于其它組(P＜0.0

14、1);(2)單純衰老組大鼠垂體重量最輕，早期衰老組的垂體重量次之，單純腫瘤組垂體重量最大;(3)衰老組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞間隙擴(kuò)大，血管稀疏，無明顯的血管增生，高倍鏡下可見胞漿中可見核濃縮和脂褐素出現(xiàn)。垂體腺瘤和中期誘導(dǎo)衰老組，90％以上的細(xì)胞顯示PRL強(qiáng)陽性，早期衰老超過70％的細(xì)胞表現(xiàn)為陽性。正常對照組、衰老組PRL陽性細(xì)胞比例少于5％;(4)衰老組大鼠血清IL-6明顯低于對照組。腫瘤組血清IL-6含量與衰老組差異明顯。早期衰老組

15、及中期衰老組IL-6濃度明顯低于對照組;(5)衰老組p53、p16、p21、IL-6、C/ EBPβ基因垂體中表達(dá)明顯高于對照組和衰老腫瘤組，但是，在腫瘤組表達(dá)最低。衰老組的IL-6表達(dá)最高，在中期誘導(dǎo)衰老組幾乎無表達(dá)。早期衰老組高于單純腫瘤組和中期衰老組。p21和p16表達(dá)與IL-6幾乎相同。PTTG表達(dá)趨勢同IL-6相反。Western-blot結(jié)果表明，IL-6在腫瘤組織和正常垂體組織表達(dá)水平極低，在衰老腫瘤內(nèi)也較低。P16，p2

16、1衰老組中表達(dá)增加、在腫瘤組表達(dá)降低。
　　結(jié)論:
　　1.細(xì)胞內(nèi)在的IL-6通過癌基因誘導(dǎo)衰老參與垂體瘤的發(fā)生，被細(xì)胞內(nèi)PTTG異常表達(dá)誘導(dǎo)衰老產(chǎn)生。繞過衰老腫瘤形成。
　　2.C/EBPβ是白介素介導(dǎo)衰老途徑中一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子。其調(diào)控垂體腺瘤的形成。雌激素高表達(dá)導(dǎo)致IL-6及其轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ表達(dá)降低。IL-6-C/EBPβ通路的衰老體系難以維持。提高泌乳素腺瘤中IL-6水平會(huì)產(chǎn)生衰老，抑制腫瘤增殖。