谷實夜蛾唾液ATP水解酶介導(dǎo)番茄防御機制的研究.pdf

1、谷實夜蛾Helicoverpazea，屬鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae，是美洲地區(qū)重要的作物害蟲。在美國、加拿大、墨西哥等國均有分布。主要危害玉米、水稻、小麥、棉花、大豆等經(jīng)濟作物，其寄主范圍廣，每年均可造成嚴重的經(jīng)濟損失。番茄，屬茄科一年生草本植物。目前，全球的番茄年產(chǎn)量可達一億五千萬噸以上。然而，每年因為番茄病蟲危害造成的產(chǎn)量損失就高達34.4％。在美國，危害番茄的主要昆蟲種類就包括谷實夜蛾、茶翅蝽Halyom

2、orpha picus、番茄天蛾Manduca quinquemaculata等。目前，國內(nèi)外對谷實夜蛾的研究主要集中于形態(tài)學(xué)、生物學(xué)、生態(tài)學(xué)和化學(xué)防治等方面，少有研究從根本上明確谷實夜蛾與宿主植物之間的互作關(guān)系。昆蟲唾液和口腔分泌物等效應(yīng)子作為重要的入侵信號，可以被植物識別和利用，并介導(dǎo)植物產(chǎn)生相應(yīng)的防御反應(yīng)。為了更好地利用植物自身的防御機制和抗蟲性，建立環(huán)境友好的有害昆蟲控制策略。本學(xué)位論文在美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)與食品研究計劃(2010-

3、65105-20639)的資助下，綜合運用分子克隆、原核表達、蛋白質(zhì)純化等技術(shù)，以谷實夜蛾及其危害較為嚴重的宿主植物番茄為研究對象，探討了谷實夜蛾唾液ATP水解酶介導(dǎo)番茄植株防御反應(yīng)的作用機理。以期從理論上深化對植物防御反應(yīng)信號傳導(dǎo)途徑、昆蟲源效應(yīng)子的理解和認識，解析昆蟲源效應(yīng)子介導(dǎo)植物防御反應(yīng)的分子生物學(xué)機理，充實昆蟲與宿主植物互作關(guān)系的研究內(nèi)容。通過研究，取得以下研究結(jié)果：
　　 1、谷實夜蛾唾液和其余組織內(nèi)ATP水解酶的活

4、性鑒定
　　 采用玻璃毛細管于每10頭谷實夜蛾收集到的唾液總蛋白濃度為0.2±0.0μg·μl-1，其ATP水解比活力為93.9±3.4 nmol·min-1·mg-1。熒光反應(yīng)顯示，5μl該濃度谷實夜蛾唾液5 min內(nèi)對番茄葉片胞外ATP的降解量為0.4±0.0 nmol·L-1。
　　 運用native-PAGE技術(shù)，對谷實夜蛾各組織內(nèi)具有ATP水解活性的蛋白質(zhì)分布情況進行了檢測。結(jié)果顯示，ATP水解酶普遍存在于谷實

5、夜蛾體內(nèi)的各個組織器官中，但其分布在唾液腺的量較其余組織高。
　　 2、谷實夜蛾體內(nèi)3個ATP水解酶基因克隆及表達
　　 2.1、谷實夜蛾體內(nèi)3個ATP水解酶基因克隆
　　 應(yīng)用RT-PCR和RACE技術(shù)，從谷實夜蛾唾液腺成功克隆得到3個ATP水解酶基因apyrase、ATP synthase及ATPasc13Al的cDNA全長序列，其cDNA全長分別為2，102、1，789和4，171 bp，包含1，641、1

6、，551和3，483 bp的開放閱讀框，編碼546、516和1160個氨基酸。成熟蛋白的理論分子量分別為61.2、55.2和130.2 kDa。GenBank登錄號分別為：HM569605、HM156739和HQ184468。
　　 此外，基于N端信號肽在蛋白質(zhì)跨膜運輸過程中的重要作用，對目的蛋白氨基酸序列進行了分析，以期從理論上推測谷實夜蛾apyrase、ATP synthase和ATPase13Al從唾液腺分泌至唾液中的可能

7、性。序列分析結(jié)果表明，僅apyrase含有信號肽。非經(jīng)典分泌蛋白預(yù)測軟件檢測結(jié)果亦表明，谷實夜蛾apyrase屬于分泌蛋白，且ATPase13Al的NN-score為0.767。然而，ATP synthase的NN-score為0.492，臨近非經(jīng)典分泌蛋白檢測閾值(NN-score≥0.5的蛋白質(zhì)為非經(jīng)典分泌蛋白)。該結(jié)果從理論上推測了谷實夜蛾apyrase、ATP synthase和ATPase13Al從唾液腺分泌至唾液中的可能性。

8、
　　 2.2、谷實夜蛾體內(nèi)3個ATP水解酶基因的表達水平
　　 采用qRT-PCR技術(shù)，檢測到ATP synthase和ATPase13Al基因在谷實夜蛾唾液腺內(nèi)的表達量最高，且與其余組織內(nèi)表達量的差異達到顯著水平(P<0.05)。Apyrase基因在馬氏管內(nèi)的表達量最高，是唾液腺內(nèi)表達量的1.5倍。說明ATP synthase和ATPase13Al主要的作用位點在谷實夜蛾唾液腺，apyrase則主要作用于谷實夜蛾體內(nèi)

9、的排泄和滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)。
　　 在已知谷實夜蛾唾液蛋白的合成和分泌會隨著取食飼料和宿主植物的不同而發(fā)生變化的基礎(chǔ)上，對取食不同飼料和植物后，谷實夜蛾唾液腺內(nèi)ATPase13Al基因的相對表達量進行了檢測。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)防御反應(yīng)后的番茄葉片會抑制谷實夜蛾幼蟲唾液腺ATPase13Al基因的表達，而番茄抗蟲基因缺失型突變種defl和添加3μg·g-1茉莉酸的飼料不會抑制該基因的表達。說明經(jīng)過茉莉酮酸甲酯誘導(dǎo)防御反應(yīng)后的植株葉片內(nèi)必定含

10、有某種或者某些除茉莉酸以外的其余組分抑制了ATPase13Al基因的表達，且該組分肯定與茉莉酸信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)。
　　 3、谷實夜蛾體內(nèi)3個ATP水解酶基因原核表達及鑒定
　　 應(yīng)用雙酶切和DNA重組技術(shù)，成功構(gòu)建了谷實夜蛾apyrase、ATP synthase和ATPase 13Al與pET-43.1b(+)的原核表達載體。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和SDS-PAGE鑒定，證實該表達系統(tǒng)的可操作性，實現(xiàn)了目的基因的體外表達。此外

11、，研究結(jié)果還表明，apyrase和ATP synthase融合蛋白的表達量會隨誘導(dǎo)時間的延長而增加，過夜培養(yǎng)后，表達量也仍然呈現(xiàn)上升趨勢。然而，經(jīng)過誘導(dǎo)表達5 h后，ATPase 13Al融合蛋白的表達量會逐步下降，說明一定濃度的ATPase 13Al融合蛋白會抑制宿主菌的生長。因此，在表達ATPase 13Al時，不宜長時間誘導(dǎo)。
　　 4、重組蛋白的分離純化及活性鑒定
　　 采用親和純化技術(shù)，對表達出的apyrase

12、、ATP synthase和ATPase13Al融合蛋白進行了分離純化，得到分子量分別為60.0、54.5和51.7 kDa的目的蛋白。
　　 運用apyrase肽抗體(DGGDGFSMFRDGKQ)和Western blot技術(shù)，于谷實夜蛾唾液、唾液腺，以及純化產(chǎn)物中，檢測到目的蛋白apyrase的存在。
　　 Native-PAGE檢測結(jié)果顯示，經(jīng)過兩次純化后，各目的蛋白仍然具有活性。熒光反應(yīng)試驗證實，最后得到apy

13、rase、ATP synthase和ATPase 13Al的比活力分別為196.5、219.8和83.7nmol·min-1·mg-1，酶活回收率分別為111.9、231.5和70.4％。
　　 5、谷實夜蛾ATP水解酶對番茄防御反應(yīng)相關(guān)基因的影晌
　　 應(yīng)用純化后具有相等ATP水解活性的apyrase、ATP synthase和ATPase 13Al處理番茄植株(24 h)，以檢測涉及不同防御反應(yīng)信號途徑的7個基因(P

14、IN2、ARG、PPO、TD、PAL、PR-10和OSM)在各處理組植株體內(nèi)的相對表達量。結(jié)果顯示，創(chuàng)傷處理顯著誘導(dǎo)了每個基因的表達量(P<0.05)。然而，創(chuàng)傷面再經(jīng)過目的蛋白處理后，植株體內(nèi)PIN2、ARG、PPO和TD基因的表達均被顯著抑制(P<0.05)。說明谷實夜蛾ATP水解酶顯著抑制了番茄植株體內(nèi)的茉莉酸信號傳導(dǎo)途徑(P<0.05)，并且，較高比活力ATP水解酶的抑制作用更為明顯。此外，經(jīng)過較高蛋白質(zhì)濃度、低比活力的單個酶處

15、理，茉莉酸信號傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)的下游防御反應(yīng)相關(guān)基因的相對表達量越來越接近創(chuàng)傷處理組。說明蛋白質(zhì)比活力的下降削弱了谷實夜蛾ATP水解酶對番茄植株茉莉酸信號傳導(dǎo)途徑的抑制作用。
　　 其次，3個谷實夜蛾ATP水解酶對水楊酸信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)的兩個基因(PAL和PR-10)的影響卻截然相反。PAL基因的表達水平被較低比活力的apyrase和ATPase 13Al，以及較高比活力的ATP synthase抑制；PR-10基因?qū)Σ煌瑵舛群捅然?/p>

16、力的3個谷實夜蛾ATP水解酶的反應(yīng)則完全不同。據(jù)此推測，谷實夜蛾ATP synthase和其余兩種酶對各基因表達水平存在不同影響的原因可能在于，ATP synthase本身兼具ATP水解酶和合成酶活性。由于本試驗采用的活性檢測方法本身存在局限性，不能明確在反應(yīng)過程中是否有ATP被合成。因此，今后可以對谷實夜蛾ATP synthase的合成酶活性進行必要的鑒定。從各處理組PR-10基因的相對表達量可以看出，較高比活力的ATP syntha

17、se和最低比活力的ATPase 13Al對番茄植株水楊酸信號傳導(dǎo)途徑產(chǎn)生了顯著的誘導(dǎo)作用(P<0.05)。
　　 此外，較高比活力的3個谷實夜蛾ATP水解酶均對OSM基因表現(xiàn)為抑制作用。說明該3個ATP水解酶會對番茄植株乙烯信號傳導(dǎo)途徑產(chǎn)生抑制作用。
　　 6、谷實夜蛾ATP水解酶對番茄腺毛產(chǎn)量的影響
　　 植物腺毛產(chǎn)量可因植食性昆蟲的取食或機械傷害的刺激而增加，屬于被誘導(dǎo)的延遲性植物防御反應(yīng)。采用最高蛋白質(zhì)濃度

18、的3個谷實夜蛾ATP水解酶分別處理番茄植株，以檢測處理10 d后番茄植株葉片腺毛產(chǎn)量是否發(fā)生變化。結(jié)果顯示，創(chuàng)傷處理能夠顯著誘導(dǎo)番茄新生葉片的腺毛數(shù)量(P<0.05)。然而，創(chuàng)傷面再經(jīng)過各種谷實夜蛾ATP水解酶處理后，番茄新生葉片腺毛數(shù)量與未處理組(空白對照組)植株腺毛數(shù)量之間沒有顯著性差異(P>0.05)。說明谷實夜蛾ATP水解酶處理抑制了創(chuàng)傷對番茄植株新生葉片的影響。綜合對植物防御反應(yīng)相關(guān)基因的qRT-PCR檢測結(jié)果，可以看出植物信

19、號傳導(dǎo)途徑，尤其是茉莉酸信號傳導(dǎo)途徑在調(diào)控番茄植株腺毛生長過程中所起的重要作用。
　　 7、Apyrase在谷實夜蛾躲避宿主防御反應(yīng)過程中的作用
　　 谷實夜蛾唾液腺apyrase與蚊類唾液腺apyrase同屬5’-核苷酸酶家族，兩者存在較高的相似度。鑒于嗜血性昆蟲唾液腺apyrase在其躲避宿主防御反應(yīng)過程中的重要作用，以及本研究過程中發(fā)現(xiàn)的谷實夜蛾唾液腺ATP水解酶對番茄植株防御反應(yīng)信號傳導(dǎo)途徑表現(xiàn)出的抑制作用，本論