谷實(shí)夜蛾唾液ATP水解酶介導(dǎo)番茄防御機(jī)制的研究.pdf

1、谷實(shí)夜蛾Helicoverpazea，屬鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae，是美洲地區(qū)重要的作物害蟲(chóng)。在美國(guó)、加拿大、墨西哥等國(guó)均有分布。主要危害玉米、水稻、小麥、棉花、大豆等經(jīng)濟(jì)作物，其寄主范圍廣，每年均可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。番茄，屬茄科一年生草本植物。目前，全球的番茄年產(chǎn)量可達(dá)一億五千萬(wàn)噸以上。然而，每年因?yàn)榉巡∠x(chóng)危害造成的產(chǎn)量損失就高達(dá)34.4％。在美國(guó)，危害番茄的主要昆蟲(chóng)種類就包括谷實(shí)夜蛾、茶翅蝽Halyom

2、orpha picus、番茄天蛾Manduca quinquemaculata等。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)谷實(shí)夜蛾的研究主要集中于形態(tài)學(xué)、生物學(xué)、生態(tài)學(xué)和化學(xué)防治等方面，少有研究從根本上明確谷實(shí)夜蛾與宿主植物之間的互作關(guān)系。昆蟲(chóng)唾液和口腔分泌物等效應(yīng)子作為重要的入侵信號(hào)，可以被植物識(shí)別和利用，并介導(dǎo)植物產(chǎn)生相應(yīng)的防御反應(yīng)。為了更好地利用植物自身的防御機(jī)制和抗蟲(chóng)性，建立環(huán)境友好的有害昆蟲(chóng)控制策略。本學(xué)位論文在美國(guó)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)與食品研究計(jì)劃(2010-

3、65105-20639)的資助下，綜合運(yùn)用分子克隆、原核表達(dá)、蛋白質(zhì)純化等技術(shù)，以谷實(shí)夜蛾及其危害較為嚴(yán)重的宿主植物番茄為研究對(duì)象，探討了谷實(shí)夜蛾唾液ATP水解酶介導(dǎo)番茄植株防御反應(yīng)的作用機(jī)理。以期從理論上深化對(duì)植物防御反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)途徑、昆蟲(chóng)源效應(yīng)子的理解和認(rèn)識(shí)，解析昆蟲(chóng)源效應(yīng)子介導(dǎo)植物防御反應(yīng)的分子生物學(xué)機(jī)理，充實(shí)昆蟲(chóng)與宿主植物互作關(guān)系的研究?jī)?nèi)容。通過(guò)研究，取得以下研究結(jié)果：
　　 1、谷實(shí)夜蛾唾液和其余組織內(nèi)ATP水解酶的活

4、性鑒定
　　 采用玻璃毛細(xì)管于每10頭谷實(shí)夜蛾收集到的唾液總蛋白濃度為0.2±0.0μg·μl-1，其ATP水解比活力為93.9±3.4 nmol·min-1·mg-1。熒光反應(yīng)顯示，5μl該濃度谷實(shí)夜蛾唾液5 min內(nèi)對(duì)番茄葉片胞外ATP的降解量為0.4±0.0 nmol·L-1。
　　 運(yùn)用native-PAGE技術(shù)，對(duì)谷實(shí)夜蛾各組織內(nèi)具有ATP水解活性的蛋白質(zhì)分布情況進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，ATP水解酶普遍存在于谷實(shí)

5、夜蛾體內(nèi)的各個(gè)組織器官中，但其分布在唾液腺的量較其余組織高。
　　 2、谷實(shí)夜蛾體內(nèi)3個(gè)ATP水解酶基因克隆及表達(dá)
　　 2.1、谷實(shí)夜蛾體內(nèi)3個(gè)ATP水解酶基因克隆
　　 應(yīng)用RT-PCR和RACE技術(shù)，從谷實(shí)夜蛾唾液腺成功克隆得到3個(gè)ATP水解酶基因apyrase、ATP synthase及ATPasc13Al的cDNA全長(zhǎng)序列，其cDNA全長(zhǎng)分別為2，102、1，789和4，171 bp，包含1，641、1

6、，551和3，483 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼546、516和1160個(gè)氨基酸。成熟蛋白的理論分子量分別為61.2、55.2和130.2 kDa。GenBank登錄號(hào)分別為：HM569605、HM156739和HQ184468。
　　 此外，基于N端信號(hào)肽在蛋白質(zhì)跨膜運(yùn)輸過(guò)程中的重要作用，對(duì)目的蛋白氨基酸序列進(jìn)行了分析，以期從理論上推測(cè)谷實(shí)夜蛾apyrase、ATP synthase和ATPase13Al從唾液腺分泌至唾液中的可能

7、性。序列分析結(jié)果表明，僅apyrase含有信號(hào)肽。非經(jīng)典分泌蛋白預(yù)測(cè)軟件檢測(cè)結(jié)果亦表明，谷實(shí)夜蛾apyrase屬于分泌蛋白，且ATPase13Al的NN-score為0.767。然而，ATP synthase的NN-score為0.492，臨近非經(jīng)典分泌蛋白檢測(cè)閾值(NN-score≥0.5的蛋白質(zhì)為非經(jīng)典分泌蛋白)。該結(jié)果從理論上推測(cè)了谷實(shí)夜蛾apyrase、ATP synthase和ATPase13Al從唾液腺分泌至唾液中的可能性。

8、
　　 2.2、谷實(shí)夜蛾體內(nèi)3個(gè)ATP水解酶基因的表達(dá)水平
　　 采用qRT-PCR技術(shù)，檢測(cè)到ATP synthase和ATPase13Al基因在谷實(shí)夜蛾唾液腺內(nèi)的表達(dá)量最高，且與其余組織內(nèi)表達(dá)量的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。Apyrase基因在馬氏管內(nèi)的表達(dá)量最高，是唾液腺內(nèi)表達(dá)量的1.5倍。說(shuō)明ATP synthase和ATPase13Al主要的作用位點(diǎn)在谷實(shí)夜蛾唾液腺，apyrase則主要作用于谷實(shí)夜蛾體內(nèi)

9、的排泄和滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)。
　　 在已知谷實(shí)夜蛾唾液蛋白的合成和分泌會(huì)隨著取食飼料和宿主植物的不同而發(fā)生變化的基礎(chǔ)上，對(duì)取食不同飼料和植物后，谷實(shí)夜蛾唾液腺內(nèi)ATPase13Al基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)防御反應(yīng)后的番茄葉片會(huì)抑制谷實(shí)夜蛾幼蟲(chóng)唾液腺ATPase13Al基因的表達(dá)，而番茄抗蟲(chóng)基因缺失型突變種defl和添加3μg·g-1茉莉酸的飼料不會(huì)抑制該基因的表達(dá)。說(shuō)明經(jīng)過(guò)茉莉酮酸甲酯誘導(dǎo)防御反應(yīng)后的植株葉片內(nèi)必定含

10、有某種或者某些除茉莉酸以外的其余組分抑制了ATPase13Al基因的表達(dá)，且該組分肯定與茉莉酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)。
　　 3、谷實(shí)夜蛾體內(nèi)3個(gè)ATP水解酶基因原核表達(dá)及鑒定
　　 應(yīng)用雙酶切和DNA重組技術(shù)，成功構(gòu)建了谷實(shí)夜蛾apyrase、ATP synthase和ATPase 13Al與pET-43.1b(+)的原核表達(dá)載體。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和SDS-PAGE鑒定，證實(shí)該表達(dá)系統(tǒng)的可操作性，實(shí)現(xiàn)了目的基因的體外表達(dá)。此外

11、，研究結(jié)果還表明，apyrase和ATP synthase融合蛋白的表達(dá)量會(huì)隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，過(guò)夜培養(yǎng)后，表達(dá)量也仍然呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。然而，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)5 h后，ATPase 13Al融合蛋白的表達(dá)量會(huì)逐步下降，說(shuō)明一定濃度的ATPase 13Al融合蛋白會(huì)抑制宿主菌的生長(zhǎng)。因此，在表達(dá)ATPase 13Al時(shí)，不宜長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)。
　　 4、重組蛋白的分離純化及活性鑒定
　　 采用親和純化技術(shù)，對(duì)表達(dá)出的apyrase

12、、ATP synthase和ATPase13Al融合蛋白進(jìn)行了分離純化，得到分子量分別為60.0、54.5和51.7 kDa的目的蛋白。
　　 運(yùn)用apyrase肽抗體(DGGDGFSMFRDGKQ)和Western blot技術(shù)，于谷實(shí)夜蛾唾液、唾液腺，以及純化產(chǎn)物中，檢測(cè)到目的蛋白apyrase的存在。
　　 Native-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)兩次純化后，各目的蛋白仍然具有活性。熒光反應(yīng)試驗(yàn)證實(shí)，最后得到apy

13、rase、ATP synthase和ATPase 13Al的比活力分別為196.5、219.8和83.7nmol·min-1·mg-1，酶活回收率分別為111.9、231.5和70.4％。
　　 5、谷實(shí)夜蛾ATP水解酶對(duì)番茄防御反應(yīng)相關(guān)基因的影晌
　　 應(yīng)用純化后具有相等ATP水解活性的apyrase、ATP synthase和ATPase 13Al處理番茄植株(24 h)，以檢測(cè)涉及不同防御反應(yīng)信號(hào)途徑的7個(gè)基因(P

14、IN2、ARG、PPO、TD、PAL、PR-10和OSM)在各處理組植株體內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，創(chuàng)傷處理顯著誘導(dǎo)了每個(gè)基因的表達(dá)量(P<0.05)。然而，創(chuàng)傷面再經(jīng)過(guò)目的蛋白處理后，植株體內(nèi)PIN2、ARG、PPO和TD基因的表達(dá)均被顯著抑制(P<0.05)。說(shuō)明谷實(shí)夜蛾ATP水解酶顯著抑制了番茄植株體內(nèi)的茉莉酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑(P<0.05)，并且，較高比活力ATP水解酶的抑制作用更為明顯。此外，經(jīng)過(guò)較高蛋白質(zhì)濃度、低比活力的單個(gè)酶處

15、理，茉莉酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)的下游防御反應(yīng)相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量越來(lái)越接近創(chuàng)傷處理組。說(shuō)明蛋白質(zhì)比活力的下降削弱了谷實(shí)夜蛾ATP水解酶對(duì)番茄植株茉莉酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑的抑制作用。
　　 其次，3個(gè)谷實(shí)夜蛾ATP水解酶對(duì)水楊酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)的兩個(gè)基因(PAL和PR-10)的影響卻截然相反。PAL基因的表達(dá)水平被較低比活力的apyrase和ATPase 13Al，以及較高比活力的ATP synthase抑制；PR-10基因?qū)Σ煌瑵舛群捅然?/p>

16、力的3個(gè)谷實(shí)夜蛾ATP水解酶的反應(yīng)則完全不同。據(jù)此推測(cè)，谷實(shí)夜蛾ATP synthase和其余兩種酶對(duì)各基因表達(dá)水平存在不同影響的原因可能在于，ATP synthase本身兼具ATP水解酶和合成酶活性。由于本試驗(yàn)采用的活性檢測(cè)方法本身存在局限性，不能明確在反應(yīng)過(guò)程中是否有ATP被合成。因此，今后可以對(duì)谷實(shí)夜蛾ATP synthase的合成酶活性進(jìn)行必要的鑒定。從各處理組PR-10基因的相對(duì)表達(dá)量可以看出，較高比活力的ATP syntha

17、se和最低比活力的ATPase 13Al對(duì)番茄植株水楊酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑產(chǎn)生了顯著的誘導(dǎo)作用(P<0.05)。
　　 此外，較高比活力的3個(gè)谷實(shí)夜蛾ATP水解酶均對(duì)OSM基因表現(xiàn)為抑制作用。說(shuō)明該3個(gè)ATP水解酶會(huì)對(duì)番茄植株乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑產(chǎn)生抑制作用。
　　 6、谷實(shí)夜蛾ATP水解酶對(duì)番茄腺毛產(chǎn)量的影響
　　 植物腺毛產(chǎn)量可因植食性昆蟲(chóng)的取食或機(jī)械傷害的刺激而增加，屬于被誘導(dǎo)的延遲性植物防御反應(yīng)。采用最高蛋白質(zhì)濃度

18、的3個(gè)谷實(shí)夜蛾ATP水解酶分別處理番茄植株，以檢測(cè)處理10 d后番茄植株葉片腺毛產(chǎn)量是否發(fā)生變化。結(jié)果顯示，創(chuàng)傷處理能夠顯著誘導(dǎo)番茄新生葉片的腺毛數(shù)量(P<0.05)。然而，創(chuàng)傷面再經(jīng)過(guò)各種谷實(shí)夜蛾ATP水解酶處理后，番茄新生葉片腺毛數(shù)量與未處理組(空白對(duì)照組)植株腺毛數(shù)量之間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。說(shuō)明谷實(shí)夜蛾ATP水解酶處理抑制了創(chuàng)傷對(duì)番茄植株新生葉片的影響。綜合對(duì)植物防御反應(yīng)相關(guān)基因的qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果，可以看出植物信

19、號(hào)傳導(dǎo)途徑，尤其是茉莉酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑在調(diào)控番茄植株腺毛生長(zhǎng)過(guò)程中所起的重要作用。
　　 7、Apyrase在谷實(shí)夜蛾躲避宿主防御反應(yīng)過(guò)程中的作用
　　 谷實(shí)夜蛾唾液腺apyrase與蚊類唾液腺apyrase同屬5’-核苷酸酶家族，兩者存在較高的相似度。鑒于嗜血性昆蟲(chóng)唾液腺apyrase在其躲避宿主防御反應(yīng)過(guò)程中的重要作用，以及本研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的谷實(shí)夜蛾唾液腺ATP水解酶對(duì)番茄植株防御反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)途徑表現(xiàn)出的抑制作用，本論