大腸桿菌氣溶膠和新甲型H1N1病毒氣溶膠發(fā)生和傳播的鑒定.pdf

1、微生物是動(dòng)物舍環(huán)境污染的主要因素，動(dòng)物舍的生物污染可以引起一系列傳染病的流行。近幾年的研究表明，一些氣載病原微生物能夠通過空氣傳播很遠(yuǎn)的距離，造成傳染病的流行。過去對(duì)畜禽養(yǎng)殖環(huán)境微生物氣溶膠的傳播主要研究對(duì)象是細(xì)菌，是通過舍內(nèi)外環(huán)境中的細(xì)菌濃度的變化以及細(xì)菌耐藥性及某些致病菌含量等來確認(rèn)的。然而，這些方法受到的影響因素很多，難以保證分類的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。未能證明舍內(nèi)外環(huán)境分離的微生物氣溶膠的起源及其同源性，沒能獲得充分的證據(jù)證明微生物氣

2、溶膠起源于養(yǎng)殖環(huán)境并向周邊及社區(qū)環(huán)境傳播。近些年，以ERIC-PCR和PFGE（脈沖場(chǎng)凝膠電泳）為代表的分子生物學(xué)細(xì)菌分型技術(shù)得以應(yīng)用，以鑒定不同來源細(xì)菌的同源性，追溯其來源。并且，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷變革，對(duì)畜禽舍養(yǎng)殖環(huán)境病毒氣溶膠的傳播研究也越來越廣泛。
　　 本研究分別對(duì)細(xì)菌和病毒的氣溶膠發(fā)生和傳播做了相關(guān)研究。對(duì)細(xì)菌，以大腸桿菌為指示菌，采用Andersen-6級(jí)空氣微生物樣品收集器，分別在5個(gè)雞場(chǎng)舍內(nèi)空氣、舍外上風(fēng)

3、向 10m，50m和下風(fēng)向 10m，50m，100m,200m,400m的距離處收集空氣樣品，每個(gè)動(dòng)物舍設(shè)三點(diǎn)采樣，每次重復(fù)采集5個(gè)樣本。同時(shí)采集雞的糞便,分離、鑒定大腸桿菌，計(jì)算每一個(gè)采樣點(diǎn)大腸桿菌的濃度(CFU·m?3空氣)。然后，對(duì)每個(gè)雞舍，先采用ERIC-PCR對(duì)不同來源（糞便、舍內(nèi)、外不同距離空氣樣品）的大腸桿菌分離株進(jìn)行基因分型，然后對(duì)ERIC-PCR相似系數(shù)在90％以上的菌株，再采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）技術(shù),進(jìn)行同源

4、性鑒定，準(zhǔn)確確認(rèn)細(xì)菌的來源。根據(jù)每個(gè)采樣點(diǎn)大腸桿菌濃度的變化以及在不同采樣點(diǎn)分離的大腸桿菌的遺傳距離，確認(rèn)動(dòng)物舍內(nèi)微生物氣溶膠的起源及其向舍外環(huán)境傳播。對(duì)病毒，分別在山東省德州、濟(jì)寧、萊蕪、臨沂、青島、濰坊、煙臺(tái)、東營(yíng)等地的養(yǎng)豬場(chǎng)的舍內(nèi)和舍外下風(fēng)向10m、20m，用AGI-30采集空氣樣品，每個(gè)采樣點(diǎn)重復(fù)采集3個(gè)樣品，并采集棉拭子。在泰安市岱岳區(qū)采集豬血樣品，進(jìn)行血凝及血凝抑制試驗(yàn)，以檢測(cè)抗體效價(jià)。在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)門診及富農(nóng)門診收集病死豬

5、病料、棉拭子、血液進(jìn)行處理。運(yùn)用熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)新型H1N1病毒的含量，探討豬舍中新型H1N1病毒的氣溶膠的傳播。本實(shí)驗(yàn)共分離到118株大腸桿菌。從濃度來看,5個(gè)雞場(chǎng)舍內(nèi)空氣中大腸桿菌的濃度為11-56 CFU·m-3空氣，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于舍外上風(fēng)和舍外下風(fēng)處的大腸桿菌濃度(P<0.05)，顯示了舍內(nèi)微生物氣溶膠不斷產(chǎn)生和集聚；然而，舍外下風(fēng)不同距離間的大腸桿菌濃度差異并不顯著(P>0.05)，顯示來源于雞舍內(nèi)的氣載大腸桿菌能夠傳播

6、到一定了距離。通過ERIC-PCR篩選出來26組大腸桿菌，共82株大腸桿菌同源性高于90％。各組內(nèi)菌株均需要運(yùn)用脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步基因分型。ERIC-PCR和PFGE兩種方法相結(jié)合進(jìn)行同源性鑒定顯示，從雞的糞便中分離到的大腸桿菌與從舍內(nèi)空氣中分離到的部分大腸桿菌(17.1％)具有相同來源；從雞場(chǎng)舍外下風(fēng)方向(10m，50m，100m,200m)分離到的多數(shù)大腸桿菌(59.1％)與舍內(nèi)空氣或糞便中分離的大腸桿菌來源相同。而從雞舍

7、上風(fēng)分離到的大腸桿菌與舍內(nèi)空氣或糞便中分離的大腸桿菌相似指數(shù)較?。?80％），表明這些細(xì)菌并非來源于該雞舍。舍外下風(fēng)向各采樣點(diǎn)分離的大腸桿菌與上風(fēng)向10m，50m分離得的大腸桿菌同源性較低，排除下風(fēng)向采得的大腸桿菌來自上風(fēng)向的可能。而很多從舍內(nèi)空氣和舍外下風(fēng)方向分離到的大腸桿菌與糞便中的相似指數(shù)較高（＞85％），說明糞便中的細(xì)菌能夠形成氣溶膠，并且通過舍內(nèi)外氣體交換傳播到舍外，依氣象條件傳播到舍外不同的距離。造成周邊環(huán)境的生物污染以及病

8、原微生物的擴(kuò)散，給鄰近的社區(qū)居民形成感染風(fēng)險(xiǎn)。
　　 本研究建立了在線檢測(cè)新型H1N1病毒的熒光定量RT-PCR方法，本次試驗(yàn)共對(duì)山東省九個(gè)地區(qū)40個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)，及山東農(nóng)業(yè)大學(xué)門診進(jìn)行了樣品采集，共采集到空氣樣品和棉拭子樣品162份，血液樣品27份。其中，舍外20米的37個(gè)樣品均為陰性，舍外十米37個(gè)樣品有3個(gè)樣品為陽性，濰坊1個(gè)，德州2個(gè)。本實(shí)驗(yàn)共收集40個(gè)豬場(chǎng)157個(gè)空氣樣品，其中41個(gè)樣品為陽性，陽性率為26％。27份血清樣品