番茄枯萎病和梨輪紋病生防菌控病機(jī)制研究及幾丁質(zhì)酶基因的克隆與表達(dá).pdf

1、由尖孢鐮刀菌番茄?；蚚Fusarium oxysporum f.sp.licopersici(saec) snyderetHansen]引起的番茄枯萎病和貝倫格葡萄座腔菌梨生?；虰otryosphaeriaberengeriana de.Not.f.sp.piricola(Nose)引起的梨輪紋病全國普遍發(fā)生。生物防治植物病害能降低農(nóng)產(chǎn)品表面化學(xué)殺菌劑的殘留量，保護(hù)生態(tài)環(huán)境和人類健康。
　　 我們采集不同地區(qū)樣本，以兩種病原

2、菌為靶標(biāo)菌，分離、篩選對(duì)枯萎病菌或輪紋病菌具有很強(qiáng)拮抗作用的菌株，進(jìn)行種屬鑒定。初步研究拮抗細(xì)菌產(chǎn)生的抑茵物質(zhì)及控病促生作用機(jī)制，克隆生防相關(guān)基因．幾丁質(zhì)酶基因。同時(shí)還研究了拮抗菌株之間互作、微生物．化學(xué)物質(zhì)（殺菌劑、NaHC03）協(xié)同作用與防效之間的相關(guān)性。研究結(jié)果表明：
　　 1、22株拮抗細(xì)菌對(duì)番茄枯萎病菌具有較強(qiáng)的室內(nèi)抑制作用，其中菌株P(guān)TS-394、H-70、L-1和SJ-280抑制率最高；22株細(xì)菌均能分泌蛋白酶；其

3、中菌株C8-8能分泌幾丁質(zhì)酶；有3株細(xì)菌能分泌纖維素酶；3株細(xì)菌能分泌嗜鐵素。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明：拮抗細(xì)菌PTS-394對(duì)番茄枯萎病的防效最高，為77.40％;菌株H-70、L-1和SJ-280對(duì)番茄枯萎病的防效均大于60%。對(duì)上述四株拮抗細(xì)菌進(jìn)行16s rRNA種屬鑒定，均為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
　　 2、利用PCR方法從菌株C8-8中克隆到編碼幾丁質(zhì)酶的chiA基因。同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)該基因序列與粘

4、質(zhì)沙雷氏菌的chiA有97%以上的相似性。酶切后連接到質(zhì)粒28a中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5c~，擴(kuò)增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒28a(chiA)并轉(zhuǎn)入到表達(dá)宿主大腸桿菌DH3中。DH3ChiA菌株在幾丁質(zhì)培養(yǎng)基上能產(chǎn)生透明的水解圈，具有幾丁質(zhì)酶活性，超聲波破碎后SDS-PAGE電泳顯示為一條相對(duì)分子質(zhì)量約為60KDa的蛋白質(zhì)，該蛋白具有較強(qiáng)的室內(nèi)抑菌活性。
　　 3、拮抗細(xì)菌C8-8的最適培養(yǎng)溫度為30℃-35℃、最適培養(yǎng)pH值為7.0-8.

5、0。培養(yǎng)時(shí)間、初始接種量對(duì)菌株C8-8的生長有明顯的影響，培養(yǎng)27h后菌液OD值最高；最佳初始接種量應(yīng)是被接種培養(yǎng)液體積的0.5-1/300。不同通氣量對(duì)菌株生長無明顯影響。不同培養(yǎng)條件（碳源、氮源、誘導(dǎo)物、溫度、時(shí)間和pH值）下菌株C8-8產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的活力差別較大。N-乙酰氨基葡萄糖能完全抑制菌株C8-8產(chǎn)酶；酵母粉和蛋白胨能使菌株C8-8酶活力明顯提高；膠體幾丁質(zhì)能誘導(dǎo)菌株C8-8產(chǎn)酶。培養(yǎng)溫度為31℃，pH值為7.3，培養(yǎng)6天時(shí)菌

6、株C8-8的酶活最高，為485μg GlcNAc·h-1。
　　 4、接種菌株C8-8能誘導(dǎo)番茄植株產(chǎn)生抗性效應(yīng)，提高植株體內(nèi)苯丙氨酸解氨酶(PAL)和過氧化物酶(POD)的酶活性；而且還有利于積累活性氧，進(jìn)一步激發(fā)寄主抗性。采用高效液相色譜HPLC對(duì)菌株C8-8代謝產(chǎn)物分析表明：該菌株C8-8在NA培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物內(nèi)存在大量的產(chǎn)生GA3，推測可能和促生作用相關(guān)，培養(yǎng)2d后產(chǎn)生的GA3為158mg/1，而IAA未測出。在基本培

7、養(yǎng)基中該菌株代謝產(chǎn)物未檢測出IAA和GA3。
　　 5、拮抗細(xì)菌之間存在多種互作關(guān)系。當(dāng)混合的2個(gè)菌株之間互作關(guān)系是親和的，其生防效果有所提高，如親和性菌株組合SJ-280+PTS394對(duì)番茄枯萎病的防效為47.1%，明顯好于單菌株SJ-280(35.3%)和PTS394(38.7%)的防效。當(dāng)混合的2個(gè)菌株之間互作關(guān)系是不親和的，有的菌株組合生防效果下降，如不親和性菌株組合C8-8+ PTS394的防效為23.5%，明顯低于單

8、菌株C8-8(52.8%)和PTS394(38.7%)的防效；有的菌株組合生防效果提高，如不親和性菌株組合L-I+PTS394的防效為50.0%，明顯好于單菌株L-1(29.4%)和PTS394(38.7%)的防效。
　　 6、分離樣本，獲得21株對(duì)梨輪紋病菌茵絲生長有較強(qiáng)的拮抗能力的菌株，其中拮抗性能最好的細(xì)菌sf628抑菌圈直徑達(dá)45 mm，抑制率達(dá)59.21%。梨果接種試驗(yàn)結(jié)果表明：21株拮抗能力較強(qiáng)的細(xì)菌中有5株拮抗細(xì)菌

9、對(duì)梨輪紋病菌引起的病斑擴(kuò)展抑制率大于50%，其中菌株sf628抑制率述60.61%。進(jìn)一步的理化特性和分子鑒定結(jié)果表明，菌株sf628為枯草芽孢桿菌枯草亞種。
　　 7、常見26種化學(xué)藥劑對(duì)梨輪紋病菌的室內(nèi)毒力測定結(jié)果表明：25%敵力脫能有效抑制梨輪紋病菌菌絲生長，ECso值為0.1522μg/ml.將拮抗細(xì)菌sf628與25%敵力脫進(jìn)行復(fù)配，結(jié)果表明配比為1:3，1:2、1:1、2:1時(shí)增效比均大于1.5，表明有增效作用。其中

10、配比為1:3時(shí)對(duì)梨輪紋病菌的毒力最強(qiáng)，增效比為2.942。拮抗細(xì)菌sf628與25%敵力脫配比為3:1時(shí)，增效比為1.071，表明兩種單劑復(fù)配后有相加作用。
　　 8、室內(nèi)抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明：生防菌單劑對(duì)梨輪紋病菌的防效為75.77-85.41%;與NaHC03協(xié)同作用后防效提高，為83.00-90.23%。以生防茵11為例，梨果試驗(yàn)結(jié)果表明：先接種病菌再噴施生防茵時(shí)，對(duì)梨輪紋病的防效為23.83%;與NaHC03協(xié)同作用后防效提