蘋果枝干輪紋病抗病性狀分子標(biāo)記及幾丁質(zhì)酶基因克隆研究.pdf

1、蘋果(MalusdomesticaBorkh.)枝干輪紋病是目前我國(guó)蘋果生產(chǎn)上危害嚴(yán)重、發(fā)生普遍的病害之一，在我國(guó)北方蘋果產(chǎn)區(qū)，特別是山東地區(qū)普遍發(fā)生，并有逐漸加重的趨勢(shì)。傳統(tǒng)的雜交育種方法，周期較長(zhǎng)，然而，通過(guò)DNA分子技術(shù)，尋找與高抗病性狀緊密連鎖的DNA分子標(biāo)記，作為雜交育種后代輔助選擇的工具，可以加速常規(guī)抗病育種進(jìn)程。另外，蘋果枝干輪紋病是由輪紋病菌（Botryosphaeriaberengerianaf.sp.piricola

2、）侵染枝干而引起的，幾丁質(zhì)酶是一種由單基因編碼的降解幾丁質(zhì)的糖苷酶，可以降解真菌細(xì)胞壁的主要成分幾丁質(zhì)，從而抑制真菌的生長(zhǎng)與繁殖，因此幾丁質(zhì)酶基因在植物的抗病育種中有重要的研究?jī)r(jià)值。
　　 本研究以蘋果品種‘舞姿’(Telamon)ב短枝富士’（SpurFuji）的15a生雜交后代群體104株植株為試材，根據(jù)田間發(fā)病情況的調(diào)查結(jié)果，采用集群分類法(Bulkedsegregantanalysis，BSA)對(duì)蘋果枝干輪紋病抗病性狀

3、進(jìn)行了SSR(Simplesequencerepeat)分子標(biāo)記研究。同時(shí)，利用同源克隆和RACE方法從蘋果莖尖中克隆到蘋果幾丁質(zhì)酶基因的全長(zhǎng)序列，并對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析及組織表達(dá)研究。獲得的研究結(jié)果如下:
　　 1.通過(guò)對(duì)來(lái)自蘋果、梨基因組的共289對(duì)SSR引物的篩選，獲得了2個(gè)與控制枝干輪紋病抗病性狀相關(guān)的SSR標(biāo)記:Hi02a09和Hi04g11。從而可以推測(cè)在蘋果公共遺傳圖譜的第11連鎖群上存在與抗病性狀相關(guān)的主效

4、基因。
　　 2.從蘋果莖尖中克隆到幾丁質(zhì)酶基因的cDNA全長(zhǎng)序列，命名為MdChi(GenBank登錄號(hào):HQ416905)。其長(zhǎng)度為1158bp，包括完整的開放閱讀框954bp，編碼317個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為8.30，推斷分子量為33.8388KDa，分子式為:C1485H2263N413O460S18.該序列所編碼的蛋白屬于糖苷水解酶19家族的幾丁質(zhì)酶，與黃冠梨PyChi1核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分別為87.96％和9

5、5.27％。
　　 3.根據(jù)獲得的MdChi的cDNA序列，設(shè)計(jì)特異引物，擴(kuò)增MdChi基因的gDNA全長(zhǎng)序列，同時(shí)利用Spidey程序分析其對(duì)應(yīng)的外顯子和內(nèi)含子。結(jié)果表明蘋果MdChi的gDNA全長(zhǎng)為2515bp，含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。
　　 4.運(yùn)用生物信息學(xué)方法，對(duì)蘋果MdChi的核苷酸及編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:MdChi編碼的幾丁質(zhì)酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)是由大量的α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和少量的擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)組成

6、;該幾丁質(zhì)酶屬于幾丁質(zhì)酶19家族，具有幾丁質(zhì)酶19家族顯著的結(jié)構(gòu)域:羧基端的幾丁質(zhì)結(jié)合域和氨基端的糖苷水解酶19家族的保守域;利用同源模型構(gòu)建了MdChi的空間三維結(jié)構(gòu);同源性分析表明，MdChi與已報(bào)道的其它植物的幾丁質(zhì)酶基因編碼的氨基酸序列具有較高的同源性。
　　 5.利用real-timePCR定量檢測(cè)輪紋病菌不同侵染時(shí)期蘋果莖尖中MdChi的表達(dá)狀況，發(fā)現(xiàn)感病個(gè)體中該基因在不同時(shí)期的表達(dá)量均較高。可以推測(cè)，在發(fā)病個(gè)體上，