藥物誘導(dǎo)性反轉(zhuǎn)雞、鵪鶉及其屬間雜交種胚胎性別相關(guān)基因表達(dá)規(guī)律的研究.pdf

1、禽類的胚胎發(fā)育過程十分復(fù)雜，導(dǎo)致胚胎死亡的因素是多方面的。雞與鵪鶉屬間雜交的早期胚胎發(fā)育過程有一個(gè)死亡高峰期，至出殼后鑒定個(gè)體全部為雄性且完全不育，這些現(xiàn)象用普通意義上的胚胎死亡原因無法解釋。本研究主要從形態(tài)學(xué)上觀察雞與鵪鶉屬間雜交種的形態(tài)發(fā)育差異，通過胚蛋注射的方法對(duì)雞、鵪鶉以及其屬間雜交種胚胎進(jìn)行處理，觀察Formestane和17 β-estradiol 對(duì)其性別分化的影響，探討ER等基因在雞、鵪鶉以及其屬間雜交種胚胎藥物處理前后

2、基因表達(dá)規(guī)律與雞與鵪鶉屬間雜交種胚胎早期死亡的關(guān)系而展開本實(shí)驗(yàn)。
　　 1 雞、鵪鶉以及其屬間雜交種胚胎發(fā)育的形態(tài)學(xué)觀察目前關(guān)于雞和鵪鶉胚胎發(fā)育形態(tài)的研究已有較詳細(xì)的報(bào)道，但對(duì)雜交禽胚胎發(fā)育形態(tài)的實(shí)驗(yàn)研究未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以雜交禽、鵪鶉和雞為實(shí)驗(yàn)材料，從其入孵至出雛，取活體胚胎做解剖和拍照，通過解剖顯微鏡觀察其發(fā)育特征，進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明：雜交禽、鵪鶉以及雞的胚胎從整體上觀察，形態(tài)發(fā)育差異不大；時(shí)間上比較，雜交禽發(fā)育進(jìn)程比雞的

3、快比鵪鶉慢，并且在9 天之前差異較大。
　　 2 Formestane和17 β-estradiol 誘導(dǎo)雞、鵪鶉胚胎性反轉(zhuǎn)的研究性激素對(duì)孵化早期的家禽胚胎性別有很大影響，給正常孵化的雞、鵪鶉種蛋注射17 β-雌二醇和芳香化酶抑制劑，可分別將其性別誘導(dǎo)為雌性和雄性。為了研究驗(yàn)證Formestane和17 β-estradiol 對(duì)雞和鵪鶉胚胎性分化的影響，本試驗(yàn)根據(jù)家禽性別分化的機(jī)理，利用100μg/ml的Formestane和

4、50μg/ml的17 β-estradiol，通過胚蛋注射的方法對(duì)3日齡的雞胚和2日齡的鵪鶉胚進(jìn)行處理，觀察Formestane和17 β-estradiol 對(duì)鵪鶉性別分化的影響。結(jié)果表明，注射Formestane和17 β-estradiol的雞胚和鵪鶉胚都發(fā)生了性反轉(zhuǎn)。同時(shí)對(duì)雜交禽也采取和鵪鶉同樣的方法進(jìn)行處理，但結(jié)果顯示死亡率很高，出殼率基本為零。據(jù)此推測(cè)，注射藥物引起基因表達(dá)紊亂很可能也是雜交種全部死亡的原因之一。
　　

5、 3 ER、3 β-HSD、P450c17和P450arom基因的表達(dá)量分析鳥類胚胎的性分化在早期受性激素影響，特別是雌激素在性分化中起著非常重要的作用。而體內(nèi)雌激素一般是由膽固醇轉(zhuǎn)化產(chǎn)生，這一轉(zhuǎn)化過程需要羥基類固醇脫氫酶（在家禽中主要有3 β-HSD及P-450c17等類固醇類基因）和P450arom基因的作用。本實(shí)驗(yàn)采集72、96、120、144、168、192h的雞、鵪鶉和雜交種胚胎各10 枚，在胚胎性別鑒定的基礎(chǔ)上，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒

6、光定量PCR 方法檢測(cè)ER、3 β-HSD、P450c17和P450arom 四個(gè)基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)作為ER的調(diào)控基因，3 β-HSD、P450arom和P-450c17基因的表達(dá)在雜交種中都表現(xiàn)出提前表達(dá)的趨勢(shì)，而ER 既提前表達(dá)，而且其表達(dá)的量也表現(xiàn)出與其親本有較大差異，同時(shí)其表達(dá)的時(shí)間與其胚胎死亡的時(shí)間基本吻合，因此可以猜測(cè)ER很可能在雜交種胚胎早期死亡中起著較為關(guān)鍵的作用。
　　 4 凋亡因子bcl-2和p53基因的表達(dá)

7、量分析雞和鵪鶉胚胎發(fā)育早期各個(gè)時(shí)間段bcl-2、P53基因表達(dá)模式的研究尚未見報(bào)道，本試驗(yàn)采集72、96、120、144、168、192h的雞、鵪鶉和雜交種胚胎各10 枚，在胚胎性別鑒定的基礎(chǔ)上，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法檢測(cè)bcl-2和p53基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)雌性胚胎bcl-2表達(dá)高峰點(diǎn)與其P53表達(dá)最低水平相吻合；與雞和鵪鶉胚胎比較，雜交胚胎在72、120 h bcl-2、P53基因表達(dá)出現(xiàn)異常，因此可以猜測(cè)bcl-2、P53基因

8、異常表達(dá)很可能也是引起雜交種胚胎早期死亡的原因之一。5性誘導(dǎo)后ER等基因的表達(dá)量分析性激素在鳥類早期胚胎的性分化過程中有很大的影響，本試驗(yàn)采用熒光定量PCR 方法研究外源激素處理的雞和鵪鶉胚胎不同時(shí)期的ER、3 β-HSD、P450c17、P450arom、bcl-2和p53基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)和正常情況下比較，ER等基因表達(dá)出現(xiàn)紊亂，這種情況與外源激素處理的雞和鵪鶉胚胎死亡率高基本吻合，可以猜測(cè)這也可能是引起藥物注射后雜交胚胎死亡率高，出殼