高產(chǎn)EPS的Pantoea ananatis野生株變異體的分離、鑒定及其作用機(jī)理研究.pdf

1、Pantoea ananatis(P.ananatis)是一種對(duì)許多重要經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物造成廣泛危害的革蘭氏陰性菌，尤其在麥穗成熟期侵染水稻而造成白葉枯病和不實(shí)，侵染洋蔥的葉和莖，造成洋蔥“中心腐爛”疾病和洋蔥葉彎落。然而，P.ananatis的主要致病因子尚未完全明確。
　　 已有研究證實(shí)該植物病原菌毒性與其生產(chǎn)胞外多糖(EPS)相關(guān)。胞外多糖在植物病原菌入侵植物體，生物膜形成和枯萎病誘導(dǎo)方面起著至關(guān)重要的作用，被認(rèn)為是許多植物病原

2、菌的致病性決定性因素。研究表明，Pantoea stewartii一種引起玉米病變的病原體，其致病性隨著胞外多糖合成基因群的突變而喪失。Erwinia amylovora，其變異體由于缺乏合成胞外多糖基因，致病性也隨之減小。因此可以推斷胞外多糖的合成與P.ananatis的病原性相關(guān)。本課題的研究目的就是確認(rèn)并分離能大量生產(chǎn)胞外多糖的P.ananatis野生株的變異體，提取變異體的質(zhì)粒DNA，鑒定突變基因，從而分析其與過量生產(chǎn)胞外多糖的

3、關(guān)系。
　　 為了鑒定能大量生產(chǎn)胞外多糖的變異體的基因，用電擊轉(zhuǎn)化法將轉(zhuǎn)座子Tn5-OT182導(dǎo)入P.ananatis野生株。利用含四環(huán)素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)得到野生株變異體的克隆體，克隆體于含四環(huán)素的TSB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，一共得到大約3000個(gè)生產(chǎn)胞外多糖變異體的克隆體，并成功分離出其中21個(gè)能大量生產(chǎn)胞外多糖的變異體。為了確認(rèn)變異基因，抽出變異體的染色體DNA，用四種限制性內(nèi)切酶EcoRI，SacI，XhoI或HindⅢ進(jìn)行酶切，

4、染色體片段自我連結(jié)后導(dǎo)入大腸桿菌，用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后得到形質(zhì)轉(zhuǎn)換體。采用改良的堿裂解法提取質(zhì)粒，通過BigDye Terminatorver.3.1和ABI Prism3100基因分析儀進(jìn)行DNA測(cè)序。特異性的引物與其互補(bǔ)的序列雜交，將獲得的DNA序列與DDBJ/EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫比較，推斷突變基因的表達(dá)功能。
　　 突變體33，91，40，11，46，81，29和98的突變基因分別與已知基因高度相似。能大量生產(chǎn)胞外