植物與核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)互作分子生物學的初步研究.pdf

1、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)是世界上破壞性最強的植物病原物之一，引起的菌核病是世界性重要病害，每年造成巨大經濟損失，是農業(yè)生產上迫切需要解決的重要問題。目前對植物與核盤菌互作分子機理的研究還很粗淺。本研究采用生理和蛋白質組學方法分析了核盤菌菌齡影響致病力的機理，組合采用突變體和病毒誘導的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)技術，分離和鑒定了植物對核盤菌的抗病性調控基

2、因，獲得了以下主要研究結果：
　　 1.通過分析核盤菌菌絲培養(yǎng)時間、菌絲體濃度以及接種后的保濕時間等因子對接種后油菜植株發(fā)病的影響，建立了一套有效的基于菌絲懸浮液的核盤菌噴霧接種方法體系。從在平板活化3d后核盤菌菌落邊緣打取菌碟(Ф6mm)，按10塊·100 mL-1加入液體培養(yǎng)基中，25℃、200 r·min-1下振蕩培養(yǎng)4d，用勻漿機勻漿30s制成菌絲懸浮液，終濃度調至600nm波長下吸光度值為1.0～2.0，用空壓機噴霧接

3、種油菜植株，保濕48h。該接種方法適用于規(guī)?；参锟剐栽u價分析研究。
　　 2.分析了菌齡對核盤菌致病力的影響及其生理生化機理。發(fā)現(xiàn)幼嫩菌絲和老熟菌絲再轉接后菌絲生長速度存在顯著差異，幼嫩菌絲的生長活力明顯更高，用于獲取接種用菌絲的轉代培養(yǎng)以選取培養(yǎng)2～3d的菌落邊緣的幼嫩菌絲為培養(yǎng)源為宜。不同年齡菌絲的致病力比較分析結果表明，老熟菌絲的致病力顯著低于幼嫩菌絲。與幼嫩菌絲相比，老熟菌絲接種油菜植株后產生的果膠酶活性以及草酸含量均

4、顯著降低，表明果膠酶活性以及草酸含量的顯著降低是導致老熟菌絲的致病力顯著下降的重要原因。
　　 3.采用蛋白質組學方法比較分析了幼嫩菌絲和老熟菌絲的蛋白質表達譜。發(fā)現(xiàn)幼嫩菌絲和老熟菌絲蛋白質豐度變化在2倍以上的差異表達蛋白點99個。通過MALDI-TOF-TOF-MS質譜分析成功鑒定了其中95個。其中約三分之二(59個)在老熟菌絲中表達下調，三分之一(36個)表達上調。這些差異表達蛋白主要涉及代謝(43％)、多功能(11％)、細

5、胞骨架和細胞完整性(7％)、氨基酸轉運與代謝(7％)、蛋白降解與裂解(6％)、蛋白合成(5％)、轉錄調節(jié)(4％)、抗氧化調節(jié)(4％)、信號傳導(3％)、誘導植物防衛(wèi)反應(1％)，另外有9％蛋白的功能未知。差異表達蛋白中有12％與草酸合成的調控相關，這些差異表達蛋白功能分析揭示了導致老熟菌絲中草酸合成能力下降的兩方面機理。一方面是包括4個草酰乙酸乙基水解酶(Oxaloacetate acetylhydrolase)蛋白，1個異檸檬酸裂解酶

6、(Isocitrate lyase)，以及1個異檸檬酸脫氫酶(Isocitrate/isopropylmalatedehydrogenase)等在內的草酸合成關鍵正向調控酶在老熟菌絲中的蛋白含量均顯著下降，另一方面是3個檸檬酸合成酶(Citrate synthase)在老熟菌絲中的蛋白含量則顯著增加，導致合成草酸的直接底物草酰乙酸顯著減少。此外，與基因轉錄、蛋白合成、呼吸、核質問轉運相關的蛋白在老熟菌絲中的積累量均顯著下降，說明這些活動

7、在老熟菌絲中受到抑制。差異表達蛋白功能分析還表明在老熟菌絲中通過激活多種途徑協(xié)調保持細胞結構的完整性。這些結果增進對核盤菌菌絲老熟的生理和致病力變化及其分子機理的理解。
　　 4.組合采用突變體和VIGS技術，篩選鑒定了一批植物對核盤菌的抗病性調控基因。采用VIGS技術分析了13個本氏煙基因對核盤菌的抗性調控功能，發(fā)現(xiàn) b12(Mitogen-activated protein kinase1)、b16(Small GTP-bi

8、nding protein)和24(Protein disulfide isomerase)沉默后植株的菌核病病害癥狀比對照顯著加重，而b60(Lemir)沉默后的植株病害癥狀則比對照顯著減弱，說明b12、b16和24可能正調控、而b60可能負調控本氏煙對核盤菌的抗性。另外，以擬南芥突變體為材料，對WRKY基因家族、MPK和AG01基因的抗病調控作用進行了分析。與野生型對照相比，接種核盤菌后agol-36、wrky6和wrky31擬南芥