小麥WK蛋白激酶互作候選蛋白的初步驗(yàn)證及其分子生物學(xué)特性分析.pdf

1、高等植物在生長(zhǎng)過(guò)程中經(jīng)常受到干旱、高溫、低溫、高鹽等非生物的脅迫，植物能夠快速感知這些不良環(huán)境的變化且主動(dòng)適應(yīng)，而適應(yīng)的過(guò)程就涉及到細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞間的信號(hào)傳遞。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化是生物體內(nèi)能量代謝以及信號(hào)傳遞中的重要生化反應(yīng)，而蛋白質(zhì)的磷酸化主要是在蛋白激酶的催化下完成的。對(duì)小麥蛋白激酶的研究將為小麥的生理代謝和耐脅迫性的機(jī)制提供有利的依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)以小麥中蛋白激酶WK為誘餌通過(guò)酵母雙雜交篩選得到WD40和MAPK3蛋白，主要驗(yàn)證WK

2、與WD40和MAPK3之間的相互作用，并對(duì)WD40和MAPK3分別進(jìn)行了表達(dá)特性分析、組織特異性分析以及亞細(xì)胞定位分析，主要獲得的研究結(jié)果如下:
　　 (1)將WD40與MAPK3的全長(zhǎng)基因分別構(gòu)建到了pGADT7載體上，WK構(gòu)建到pGBKT7的載體上，進(jìn)行酵母雙雜交驗(yàn)證其互作，結(jié)果在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal顯藍(lán)板上有菌落生長(zhǎng)并顯蘭，經(jīng)過(guò)測(cè)序比對(duì)證明是陽(yáng)性克隆，表明WD40、MAPK3和WK在

3、酵母體內(nèi)是互作的。
　　 (2)小白麥經(jīng)過(guò)低溫、干旱、ABA、NaCl脅迫處理后，以各處理小白麥的cDNA為模板對(duì)WD40進(jìn)行了瞬時(shí)表達(dá)分析，經(jīng)過(guò)ABA、干旱、NaCl、MeJA脅迫處理小白麥后，以各個(gè)處理后小白麥的cDNA為模板對(duì)MAPK3進(jìn)行了瞬時(shí)表達(dá)分析。結(jié)果表明干旱在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)WD40有明顯的上調(diào)作用，在轉(zhuǎn)錄水平上MAPK3對(duì)ABA，NaCl脅迫有強(qiáng)烈的響應(yīng)。
　　 (3)分別將WD40與MAPK3構(gòu)建到了綠色

4、熒光蛋白GFP上，利用基因槍介導(dǎo)法轟擊洋蔥表皮，培養(yǎng)后在熒光聚焦顯微鏡下觀察定位情況，用GFP做的空對(duì)照在整個(gè)細(xì)胞內(nèi)都有信號(hào)，而WD40只有在細(xì)胞核中才能看到熒光，MAPK3在細(xì)胞膜和細(xì)胞核中都能看到，結(jié)果表明WD40定位在細(xì)胞核中，MAPK3定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞核上。
　　 (4)將WD40與MAPK3分別構(gòu)建到了真核表達(dá)載體PBI121上，并轉(zhuǎn)到了農(nóng)桿菌C58Cl中，運(yùn)用農(nóng)桿菌侵染花序法將WD40與MAPK3轉(zhuǎn)到野生型擬南芥中