PAK1互作蛋白ZCW生物學(xué)特性的研究.pdf

1、本研究在李豐教授前期工作基礎(chǔ)上，采用BGC-823和SGC-7901等胃癌細(xì)胞系為研究對象，在體外和體內(nèi)進(jìn)一步證實(shí)PAK1蛋白與ZCW蛋白相互作用并確定磷酸化位點(diǎn)；用染色質(zhì)免疫沉淀和啟動子報(bào)告基因等分子細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)研究PAK1調(diào)控ZCW轉(zhuǎn)錄因子的功能及其機(jī)制，探討在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為胃癌治療提供藥物靶點(diǎn)。 研究方法： 1、GST-pull down實(shí)驗(yàn)體外證實(shí)PAK1能與ZCW發(fā)生相互作用。 克隆PAK1

2、和ZCW基因的cDNA全長，構(gòu)建不同質(zhì)粒載體中；GST-pulldown實(shí)驗(yàn)確定PAK1與ZCW相互作用區(qū)域。 2、激酶分析實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PAKl磷酸化ZCW，并確立磷酸化位點(diǎn)。 首先確定PAK1與ZCW磷酸化區(qū)域；在這個(gè)區(qū)域通過RXXS/T模序確立磷酸化位點(diǎn)，PCR方法進(jìn)行定點(diǎn)突變(絲氨酸或蘇氨酸一丙氨酸)并構(gòu)建GST-ZCW融合載體，純化ZCW野生型和ZCW突變體蛋白進(jìn)行體外激酶實(shí)驗(yàn)。 3、Northern Blo

3、t和Western Blot法篩選PAK1和ZCW高表達(dá)的胃癌細(xì)胞株，在ZCW低表達(dá)的SGC-7901胃癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA-3.1A-ZCW-wt，經(jīng)G418篩選并檢測建立ZCW穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞株，同時(shí)用空載體pcDNA-3.1A做對照。 4、細(xì)胞內(nèi)共定位法證實(shí)PAK1蛋白與ZCW蛋白發(fā)生相互作用。 在真核細(xì)胞中表達(dá)PAK1和ZCW，并進(jìn)行亞細(xì)胞定位；在EGF或血清刺激條件下，共轉(zhuǎn)染GFP-PAK1．wt和pcDNA

4、3.1A-ZCW-wt,觀察pcDNA3.1A-ZCWwt或內(nèi)源性ZCW的定位變化及與PAK1的共定位。 5、酵母交配實(shí)驗(yàn)證實(shí)PAK1蛋白與ZCW蛋白發(fā)生相互作用構(gòu)建誘餌蛋白pGBKT7-PAK1(1-270)和 pGBKT7-PAK1(270-545)載體：構(gòu)建其作用蛋白pGADT7-ZCW和陽性對照蛋白pGADT7-Cdc42和pGADT7-Racl的載體；酵母交配實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PAK1與ZCW蛋白相互作用。 6、免疫共沉

5、淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)PAK1蛋白與ZCW蛋白發(fā)生相互作用。 選取人胃癌7901-ZCW穩(wěn)定細(xì)胞株，以7901-3.1A穩(wěn)定細(xì)胞株為對照，在非變性條件下收集細(xì)胞，加1x IP buffer收集蛋白，超聲破碎后離心去除不溶物。加入適量的PAK1多克隆抗體，4℃輕輕搖動混勻過夜，再加入30μl protein Aagarose Beads混合2小時(shí)，以lx IP buffer洗Besds 5次，Western Blot檢測共沉淀的ZCW蛋白。進(jìn)

6、一步證實(shí)ZCW蛋白與PAKl在細(xì)胞內(nèi)的相互結(jié)合。 7、RNAi干擾技術(shù)分析ZCW的生物學(xué)功能RNAi阻斷技術(shù)PAK1表達(dá)，Western Blot方法檢測PAK1阻斷的特異性和ZCW的表達(dá)；免疫共焦激光顯微鏡原位觀察ZCW的定位變化。RNAi阻斷ZCW表達(dá)，Western Blot法篩選三對ZCW RNAi阻斷的特異性并檢測下游靶基因p21(Wafl/Cipl)表達(dá)的影響。 8、Northern Blot和RT-PCR方

7、法檢測ZCW對下游靶基因p21(Wafl/Cipl)表達(dá)的影響選取人胃癌7901-ZCW穩(wěn)定細(xì)胞株，以7901-3.1A穩(wěn)定細(xì)胞株為對照，在EGF干預(yù)的條件下，Northern Blot和RT-PCR法分別比較分析p21(Wafl/Cipl)在7901-ZCW穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株與對照組7901-3.1A穩(wěn)定細(xì)胞株的表達(dá)情況。 研究結(jié)果： 1、體外GST-pull down證實(shí)PAKl能與ZCW發(fā)生相互作用已獲得PAK1和ZC

8、W基因的編碼區(qū)全長，并構(gòu)建不同實(shí)驗(yàn)用途的質(zhì)粒載體中；GST-pull down實(shí)驗(yàn)確定PAK1與ZCW能相互作用。結(jié)果顯示PAK1與ZCW的C-末端657-781AA區(qū)域發(fā)生作用，而ZCW與PAK1 N-末端的75-132AA區(qū)域相互作用。 2、激酶分析實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ZCW是PAKl磷酸化的底物。 激酶實(shí)驗(yàn)分析PAKl蛋白與ZCW蛋白C-末端657-781區(qū)域發(fā)生磷酸化。對ZCW四個(gè)磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變(Ser→Ala)，對

9、突變體進(jìn)行分析，結(jié)果第663、668和711絲氨酸都能被PAKl磷酸化；而第677絲氨酸突變?yōu)楸彼岷螅荒鼙籔AKl磷酸化。因此PAK1與ZCW發(fā)生磷酸化位點(diǎn)在第677絲氨酸。 3、Northern Blot和Western Blot法選取了PAK1和ZCW高表達(dá)的胃癌BGC-823細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)對象，并選取SGC-7901胃癌細(xì)胞系建立ZCW穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。 4、細(xì)胞內(nèi)共定位法證實(shí)PAK1蛋白與ZCW蛋白發(fā)生相互作用。

10、 間接免疫熒光顯示內(nèi)源性PAK1蛋白大部分定位在BGC-823胃癌細(xì)胞的胞漿中，少量定位在細(xì)胞核。而ZCW蛋白主要定位在細(xì)胞核。在EGF或血清刺激條件下，轉(zhuǎn)染GFP-PAKl-wt或共轉(zhuǎn)pcDNA-ZCW-wt分別觀察內(nèi)源性和外源性ZCW主要定位在細(xì)胞漿，少量在細(xì)胞核，并在細(xì)胞漿中與PAK1共定位。 5、酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)PAK1蛋白與ZCW蛋白發(fā)生相互作用。 成功構(gòu)建誘餌蛋白pGBKT7-PAK1(1-270)

11、和pGBKT7-PAK1(270-545)載體和其作用蛋白pGADT7-ZCW和陽性對照蛋白pGADT7-Cdc42和pGADT7-Racl的載體，并進(jìn)行酵母交配實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PAK1(1-270)區(qū)域與ZCW蛋白相互作用。 6、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)PAK1蛋白與ZCW蛋白發(fā)生相互作用。 選取人胃癌7901-ZCW穩(wěn)定細(xì)胞株，以7901-3.1A穩(wěn)定細(xì)胞株為對照，分別用ZCW和PAK1多克隆抗體進(jìn)行免疫共沉淀，用ZCW和pcDN

12、A3.1載體上的His標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western Blot，結(jié)果檢測ZCW蛋白與PAK1在細(xì)胞內(nèi)的相互結(jié)合。 7、RNAi干擾技術(shù)研究ZCW生物學(xué)動能Western Blot方法結(jié)果檢測Specific siRNA PAK1對PAK1具有特異性的阻斷，而對高度同源的PAK2蛋白表達(dá)沒有影響。同時(shí)檢測對其作用蛋白ZCW的表達(dá)沒有影響。通過設(shè)立PAK1 siRNA和PAK1 Control siRNA，免疫共焦激光顯微鏡原位觀察PA

13、K1 siRNA組，ZCW蛋白的定位主要在細(xì)胞核；而PAK1Control siRNA組，ZCW蛋白的定位主要在細(xì)胞漿。通過Western Blot法篩選出一對高阻斷ZCW蛋白的ZCW RNAi。干擾ZCW后，Western Blot結(jié)果顯示p21(Wafl/Cipl)蛋白表達(dá)與對照組相比明顯增多；當(dāng)ZCW高表達(dá)時(shí)，WesternBlot結(jié)果顯示p21(Wafl/Cipl)蛋白表達(dá)與對照組相比明顯減少，說明ZCW下調(diào)p21(Wafl/C

14、ipl)的表達(dá)。 8、Northern Blot和RT-PCR方法檢測ZCW對下游靶基因p21(Wafl/Cipl)表達(dá)的影響選取人胃癌7901-ZCW穩(wěn)定細(xì)胞株，以7901-3.1A穩(wěn)定細(xì)胞株為對照，在EGF干預(yù)的條件下，Northern Blot和RT-PCR檢測在7901-ZCW穩(wěn)定細(xì)胞株中低表達(dá)，而在對照組7901-3.1A穩(wěn)定細(xì)胞株中p21(Wafl/Cipl)高表達(dá)。 9、利用Dual-Luciferase

15、Assay System分析ZCW對靶基因p21(Wafl/Cipl)啟動子的調(diào)控利用pGL3-P21-promoter(2.3kb)-Luciferase reporter載體，熒光結(jié)果顯示ZCW下調(diào)P21(Wafl/Cipl)-promoter的活性，同時(shí)顯示PAK1能調(diào)控ZCW對P21(Wafl/Cipl)的抑制作用。 10、染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChIP)分析ZCW蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子與靶基因p21(Wafl/Cipl)的特異

16、DNA結(jié)合選取人胃癌7901-ZCW穩(wěn)定細(xì)胞株，以7901-3.1A穩(wěn)定細(xì)胞株為對照，用ZCW特異抗體孵育，結(jié)果顯示ZCW能與p21(Wafl/Cipl)啟動子區(qū)的DNA結(jié)合。 研究結(jié)論： 1、PAK1能與ZCW的C-末端657.781AA區(qū)域發(fā)生作用，并是通過磷酸化ZCW第677絲氨酸實(shí)現(xiàn)的。而ZCW是與PAK1N-末端的75-132AA區(qū)域相互作用。 2、ZCW蛋白定位在細(xì)胞核，其定位的變化受PAK1和EGF

17、的調(diào)節(jié)，可移位到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與PAK1共定位。 3、干擾PAK1后，對細(xì)胞內(nèi)ZCW總蛋白表達(dá)沒有影響：同時(shí)也沒有引起ZCW蛋白定位的變化。 4、干擾ZCW后，能引起p21(Wafl/Cipl)蛋白高表達(dá)；在ZCW高表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株中，p21(Wafl/Cipl)蛋白低表達(dá)。 5、ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ZCW能與p21(Wafl/Cipl)啟動子區(qū)的DNA結(jié)合；報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析ZCW下調(diào)p21(Wafl/Cipl)啟動子