野大豆堿脅迫轉(zhuǎn)錄譜與基因組整合分析.pdf

1、松嫩平原西部地區(qū)是世界三大堿土集中分布區(qū)之一，面積高達(dá)373萬h㎡。在這樣的土壤環(huán)境下，植物遭受著鈉離子毒害、碳酸氫根離子毒害和pH升高引起的土壤物理性質(zhì)變化，嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。迫切需要通過基因工程技術(shù)改良作物的耐堿能力。挖掘耐堿基因，揭示其分子機(jī)理，是耐堿分子育種的重要前提。野大豆可以耐受9.02的pH環(huán)境，是進(jìn)行植物耐堿功能基因組學(xué)的理想材料。
　　 本研究以采自吉林省白城市鹽堿地的耐堿野大豆為試材，結(jié)合基因芯片技術(shù)構(gòu)建堿脅

2、迫基因轉(zhuǎn)錄譜，采用生物信息學(xué)手段，結(jié)合野大豆基因組數(shù)據(jù)，分析堿脅迫應(yīng)答基因的共表達(dá)特征、染色體聚簇和上游調(diào)控區(qū)特征，揭示堿脅迫應(yīng)答分子機(jī)制，篩選耐堿候選基因。通過本研究，將加深對植物耐堿分子機(jī)理的認(rèn)識，為作物耐堿分子育種提供基因資源和奠定理論基礎(chǔ)。本研究的主要研究結(jié)果如下：
　　 1.野大豆堿脅迫基因轉(zhuǎn)錄譜的建立
　　 用50mmol/L，NaHCO3模擬堿脅迫，處理野大豆G07256，提取RNA，與Affymetrix

3、公司的基因芯片進(jìn)行雜交，獲得了雜交質(zhì)量高、重復(fù)性好的野大豆堿脅迫基因轉(zhuǎn)錄譜。該轉(zhuǎn)錄譜包括脅迫前和脅迫后0.5h、1h、3h、6h、12h、24h共7個時(shí)間點(diǎn)，根部23741個和葉部22200個轉(zhuǎn)錄本。
　　 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對芯片雜交結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。隨機(jī)選擇的24個基因的變化趨勢與芯片結(jié)果一致，表明芯片雜交結(jié)果能夠真實(shí)地反映基因的轉(zhuǎn)錄水平變化。
　　 2.野大豆堿脅迫應(yīng)答基因的獲得
　　 采用RankP

4、rod統(tǒng)計(jì)方法分析每兩個時(shí)間點(diǎn)間基因表達(dá)量的差異顯著性（p<0.01，pfp<0.15），篩選出在某兩個時(shí)間點(diǎn)間發(fā)生了顯著變化的基因，即堿脅迫應(yīng)答基因，根部2493個，葉部2310個。通過功能富集分析發(fā)現(xiàn)，根中參與代謝過程基因顯著為堿脅迫應(yīng)答基因，葉中參與代謝過程和膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因顯著為堿脅迫應(yīng)答基因。
　　 在6h出現(xiàn)堿脅迫基因應(yīng)答高峰。在根中，參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)建成、疾病與防御、次生代謝和轉(zhuǎn)錄相關(guān)途徑的基因顯著早期應(yīng)答，在轉(zhuǎn)錄相關(guān)

5、基因中富集了WRKY轉(zhuǎn)錄因子。在葉中，參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)建成、蛋白質(zhì)合成、能量和次生代謝相關(guān)基因顯著早期應(yīng)答。利用堿脅迫前6h轉(zhuǎn)錄譜構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，鑒定出28個堿脅迫應(yīng)答關(guān)鍵基因。
　　 3.野大豆堿脅迫下共表達(dá)基因及特征
　　 為揭示堿脅迫應(yīng)答基因的共表達(dá)特征，采用適合短時(shí)間序列表達(dá)數(shù)據(jù)的聚類方法STEM進(jìn)行了聚類分析。發(fā)現(xiàn)根中有11類基因，葉中有10類基因具有顯著的共表達(dá)特征（p<0.001）。共表達(dá)基因通常包含類似功能

6、的基因，上游調(diào)控區(qū)具有共同的調(diào)控元件。共表達(dá)特性與其在基因組上的分布不存在相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)共表達(dá)基因啟動子中有21個motif對基因的共表達(dá)起重要作用，其中有12個是已知的順式作用元件。
　　 4.堿脅迫應(yīng)答miRNA篩選及調(diào)控作用分析
　　 通過將miRNA前體序列與芯片上探針組和大豆基因序列進(jìn)行BLASTn比對，發(fā)現(xiàn)有38個轉(zhuǎn)錄本能夠代表miRNA前體。獲得了根和葉中各11條堿脅迫應(yīng)答miRNA，其中7條尚未有脅迫應(yīng)答的

7、報(bào)道，為新發(fā)現(xiàn)的堿脅迫應(yīng)答miRNA。預(yù)測miRNA靶基因，發(fā)現(xiàn)堿脅迫應(yīng)答的miRNA主要通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子和激酶基因影響植物的堿脅迫應(yīng)答。
　　 5.野大豆耐堿候選基因篩選
　　 通過堿脅迫應(yīng)答基因與分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了1個功能未知基因和1個具有亮氨酸拉鏈和絲蘇氨酸磷酸轉(zhuǎn)移酶活性的基因位于耐鹽堿分子標(biāo)記附近。根據(jù)基因的堿脅迫應(yīng)答情況及功能注釋，從堿脅迫應(yīng)答基因中篩選出2個耐鹽堿分子標(biāo)記附近基因，435個有明確結(jié)構(gòu)域