轉attM基因彩色馬蹄蓮及AttM解酯酶抗體制備研究.pdf

1、彩色馬蹄蓮是天南星科（Araceae）中的一種單子葉觀賞植物，被公認為21世紀“花卉之星”，市場前景廣闊。但由胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種（Pectobacteriumcarotovora subsp.carotovora，p.c.c）引起的細菌性軟腐?。╞acterial soft rot disease）造成田間和貯藏期彩色馬蹄蓮大量腐爛死亡，且目前沒有理想的防治對策，嚴重阻礙了彩色馬蹄蓮的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。
　　 近年來的研究發(fā)

2、現(xiàn)，細菌不同細胞間存在化學信號交流，當群體信號分子達到一定密度時，菌體內相關基因即啟動表達，該現(xiàn)象被稱為群體感應（quorum sensing，簡稱QS）。在一些原核生物和真核生物中，人們已經(jīng)鑒定出一些群體感應淬滅酶（quorum-quenching enzyme），這些群體感應淬滅酶能夠降解病原菌產(chǎn)生的信號分子，使病原菌QS系統(tǒng)不能啟動它所調控的基因，從而干擾QS系統(tǒng)，減輕和消除病原菌的致病性，防治病害的發(fā)生。胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜

3、亞種是一種革蘭氏陰性細菌，其產(chǎn)生的常見信號分子是N-?；?高絲氨酸內酯類（N-Acyl-homoserine laclone，簡稱AHL）物質。迄今為止，已經(jīng)報道并研究的含群體感應淬滅酶活性的菌種不下10種，不同來源的類AHL解酯酶（AHLase）在氨基酸序列上也有所不同。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，原核生物中的AHL可以劃歸為兩個簇，即AiiA簇和AttM簇。
　　 本研究根據(jù)已報道的attM基因序列設計引物，從土壤根癌農桿菌（Agro

4、bacteriumtumefaciens）EHA105中PCR擴增獲得attM基因，并使基因兩端攜帶合適的限制性酶切位點，將其克隆入植物表達載體pBI121，構建成重組質粒pBI121-attM。重組質粒通過凍融法轉化至大腸桿菌DH5α中，經(jīng)PCR，酶切和測序驗證正確后，轉化土壤根癌農桿菌EHA105。挑選陽性克隆菌落，對其進行菌落PCR、酶切和測序驗證正確后，供轉化使用。
　　 由土壤根癌農桿菌EHA105介導，將含有nptⅡ

5、基因的重組表達質粒pBI121-attM轉化彩色馬蹄蓮的芽基盤切片，經(jīng)G-418篩選，最終從近萬塊芽基盤切片中獲得了4株陽性再生轉基因植株。經(jīng)gus染色和PCR檢測證明attM基因已整合到彩色馬蹄蓮基因組中。
　　 為進一步研究和利用attM基因，為防控細菌性軟腐病奠定基礎，本研究根據(jù)已報道的attM基因序列設計引物，從土壤根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）中PCR擴增獲得attM基因，構建蛋白表達