櫛孔扇貝急性病毒性壞死病毒基因組全序列的測(cè)定和核酸診斷技術(shù)的研究.pdf

1、櫛孔扇貝(Chlamys farreri)作為我國(guó)北方沿海特有的優(yōu)良養(yǎng)殖貝類，形成規(guī)?；B(yǎng)殖已有20多年的歷史，給我國(guó)北方沿海地區(qū)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)效益，在我國(guó)海水養(yǎng)殖業(yè)中占有重要的地位。自20世紀(jì)90年代以來(lái)，櫛孔扇貝的大規(guī)模死亡在我國(guó)北方養(yǎng)殖海區(qū)連年暴發(fā)(累積死亡率高達(dá)90％以上)，已給櫛孔扇貝養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并嚴(yán)重阻礙了這一產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。 急性病毒性壞死病毒(Acute Viral Necrobiotic Vi

2、rus，AVNV)，是引起我國(guó)北方沿海養(yǎng)殖櫛孔扇貝夏季大規(guī)模死亡(急性病毒性壞死癥)(Acute ViralNecrobiotic Disease，AVND)的病原。該病毒主要在扇貝的消化腺、外套膜、腎臟和腸等的結(jié)締組織細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，病毒呈球形，直徑大小為130～170nm，核衣殼直徑為90～140nm，囊膜厚度為5～10nm，外具放射狀纖突，纖突長(zhǎng)度約為20nm，病毒核衣殼與囊膜間有10～16nm的透明間隙，病毒核心區(qū)電子密度

3、較高。這些形態(tài)學(xué)方面的特征與此前國(guó)外報(bào)道的感染牡蠣等雙殼貝類的牡蠣皰疹病毒(Ostreid Herpesvirus1，OsHV-1)很相似。 首先應(yīng)用擴(kuò)增OsHV-1核酸序列的引物(A3/A4、C2/C6和Gp3/Gp4)，以AVNV核酸為模板進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，得到了部分AVNV的基因序列。序列分析結(jié)果顯示，AVNV和OsHV-1在A3/A4、C2/C6和Gp3/Gp4片段的核苷酸相似性分別達(dá)到了99％、96％和99％，說(shuō)明AV

4、NV和OsHV-1在核苷酸水平具有很大的相似性。根據(jù)這些已有的核苷酸序列和已經(jīng)公布的OsHV-1的全基因組序列(Gene Bank號(hào)為AY509253)設(shè)計(jì)PCR引物，運(yùn)用PCR擴(kuò)增和分子克隆等技術(shù)，建立了一系列末端相互重疊的克隆，覆蓋整個(gè)AVNV的基因組，對(duì)這些克隆進(jìn)行了測(cè)序和拼接，完成了AVNV基因組核苷酸序列的測(cè)定(GeneBank號(hào)：GQ153938)。AVNV基因組全長(zhǎng)210，993bp，A和T含量豐富，占61.5％。分析發(fā)現(xiàn)

5、，AVNV基因組的兩個(gè)末端存在較大的反向重復(fù)序列(1～7，638和178，052～185，689，187，200～197，411和200，782～210，993)，符合皰疹病毒基因組的基本特征。預(yù)測(cè)AVNV基因組中含有123個(gè)潛在的開放閱讀框(Open Reading Frames，ORF)，編碼從41個(gè)氨基酸殘基至1878個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。通過與Gene Bank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)中的核酸和蛋白質(zhì)序列的同源性分析

6、發(fā)現(xiàn)，AVNV中有44個(gè)ORF具有一定的結(jié)構(gòu)和功能，且與其它類群的核酸或蛋白質(zhì)氨基酸序列具有顯著的同源性。其功能與病毒DNA復(fù)制、核酸代謝、修飾以及病毒與宿主相互作用等有關(guān)，如DNA聚合酶(DNA polymerase)(ORF99)、解旋酶SF2 helicase(ORF66)、引物酶(Primase)(ORF24)、ATPase subunit of DNA-packagingterminase(ORF108)、核糖核苷酸還原酶小亞

7、基(Ribonucleotide reductase smallsubunit)(ORF20)、核糖核苷酸還原酶大亞基(Ribonucleotide reductase largesubunit)(ORF50)、dUTP酶(deoxyuridine triphosphatase，dUTPase)(ORF27、ORF33和ORF74)等。對(duì)這些主要基因的密碼子偏愛性、結(jié)構(gòu)域、同源性和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，推測(cè)了它們可能的功能。分析了A

8、VNV和其它貝類皰疹病毒(主要是OsHV-1)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)AVNV和OsHV-1的29個(gè)ORF編碼的蛋白質(zhì)氨基酸具有100％的同源性，3個(gè)具有81～90％的同源性，8個(gè)具有40～80％的同源性。對(duì)AVNV的分類地位進(jìn)行了探討，盡管AVNV和OsHV-1在分子水平的相似程度非常高，二者的親緣關(guān)系很近，但是二者在基因組大小和ORF編碼蛋白質(zhì)的同源性方面存在較大的差異，結(jié)合二者在宿主范圍、地理分布和流行病學(xué)等方面的不同，認(rèn)為AVNV是皰疹病毒

9、目中Malacoherpesviridae下的一個(gè)新種。 在完成AVNV基因組全序列的測(cè)定和分析的基礎(chǔ)上，針對(duì)不同樣品分析的要求，建立了AVNV PCR檢測(cè)方法、巢式PCR檢測(cè)方法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)方法和熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法，為該疾病的快速診斷、致病機(jī)理的探討、分子流行病學(xué)調(diào)查和傳播途徑的調(diào)查以及預(yù)警監(jiān)測(cè)體系的建立提供了重要的技術(shù)保障。 PCR檢測(cè)方法和巢式PCR檢測(cè)方法，應(yīng)用Primer prem

10、ier5.0設(shè)計(jì)了一步PCR引物和巢式PCR引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為706bp和314bp。對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，該兩種檢測(cè)方法的靈敏度分別為100fg和1fg的AVNV核酸，特異性實(shí)驗(yàn)表明該兩對(duì)引物只與AVNV發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)，和扇貝組織DNA以及其它水生生物病毒均無(wú)交叉反應(yīng)。該方法靈敏度高、特異性好且可以直接對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)，適合在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)大批量樣品進(jìn)行檢測(cè)。 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)方法，應(yīng)用http：//

11、primerexplorer．jp/e/在線軟件PrimerExplorer V4設(shè)計(jì)LAMP引物，其中包括兩對(duì)外引物AVNV-F3和AVNV-B3，兩對(duì)內(nèi)引物AVNV-FIP和AVNV-BIP(引物AVNV-FIP由F2、TTTT連接子和Flc組成，引物AVNV-BIP由Blc、TTTT連接子和B2組成)。對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，當(dāng)反應(yīng)混合物在64℃孵育60min時(shí)，LAMP方法能用于檢測(cè)AVNV，最低檢測(cè)靈敏度達(dá)到了1fg的AVNV核

12、酸，而且擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過肉眼直接觀察，不需要PCR儀和電泳儀等設(shè)備。LAMP是一種操作簡(jiǎn)單、靈敏度高和特異性好的檢測(cè)方法，在AVNV的簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)方面具有重要的應(yīng)用前景。 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法，根據(jù)AVNV基因序列，應(yīng)用Beacon Designer7.0設(shè)計(jì)了一對(duì)能特異性擴(kuò)增90bp片段的引物和TaqMan探針，并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。該方法在108～102病毒拷貝范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，AVNV拷貝數(shù)(X)和循環(huán)數(shù)(