甲胺磷脅迫下小白菜抗氧化機(jī)制研究.pdf

1、植物細(xì)胞即使在正常的生理?xiàng)l件下也產(chǎn)生大量的活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS或activeoxygenspecies)，在環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，如高溫、寒冷、干旱、農(nóng)藥污染等，各種ROS的產(chǎn)生速率也會(huì)大大的增加。產(chǎn)生活性氧的植物細(xì)胞器有葉綠體、線粒體、過氧化物酶體、乙醛酸循環(huán)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、微粒體、細(xì)胞膜及細(xì)胞壁等。這些ROS包括O2·-、H2O2、·OH、氫過氧基(hydyoperoxylradical，HO2·)、烷氧

2、基(alkoxyradical，RO·)、烷過氧基(peroxyradical，ROO·)、氫過氧化物(hydroperoxide，ROOH)、單線態(tài)氧(singletoxygen，102)、次鹵酸(HOX)和臭氧(O3)等。ROS對機(jī)體是有毒的，它們能破壞正常細(xì)胞的DNA、蛋白質(zhì)和膜脂等，所以細(xì)胞中ROS水平必須受到嚴(yán)格的控制，植物細(xì)胞具有完整的ROS防御系統(tǒng)，它是由抗氧化酶和抗氧化劑組成的。 本文通過研究甲胺磷脅迫下小白菜中

3、幾種抗氧化酶如超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathioneperoxidase，GPX)、細(xì)胞色素P450酶系的活性變化以及小分子抗氧化物質(zhì)谷胱甘肽(glutathione，GSH)的含量變化，并通過測定小白菜細(xì)胞內(nèi)總ROS和總抗氧化能力的變化，來初步篩選幾種對有機(jī)磷敏感的生化標(biāo)志物。然后選擇幾個(gè)敏感指標(biāo)，初步研究其對甲胺磷脅迫的應(yīng)答

4、機(jī)理，來進(jìn)一步闡明并定位有機(jī)磷對小白菜的脅迫影響機(jī)制。 1.甲胺磷脅迫下小白菜中幾種抗氧化物的變化研究 以0.5g/m2濃度的甲胺磷噴灑小白菜后，測定7d內(nèi)其體內(nèi)抗氧化酶SOD、CAT、GPX的活性及小分子抗氧化物質(zhì)GSH和系統(tǒng)總抗氧化能力的變化規(guī)律。結(jié)果表明：噴藥后2-6d小白菜中SOD、CAT、GSH都高于對照；GPX的活性在2-3d低于對照，隨后趨于穩(wěn)態(tài)；總抗氧化能力與對照相比基本處于穩(wěn)定狀態(tài)。第7d各指標(biāo)都又還原

5、到與對照接近。說明甲胺磷脅迫下小白菜體內(nèi)產(chǎn)生了氧自由基，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)防御活性氧自由基毒害的物質(zhì)產(chǎn)生，5～6d后機(jī)體恢復(fù)正常。實(shí)驗(yàn)為食品衛(wèi)生檢驗(yàn)提供了一個(gè)參考標(biāo)準(zhǔn)。 2.甲胺磷對小白菜幼苗細(xì)胞色素P450酶系的誘導(dǎo)作用及其光譜特征用4.8g/L，0.96g/L，0.096g/L3個(gè)不同濃度的甲胺磷澆灌小白菜，試驗(yàn)結(jié)果表明，小白菜幼苗在甲胺磷誘導(dǎo)下，微粒體提取上清液和微粒體蛋白含量與對照組相比均大幅升高，而且含量與農(nóng)藥濃度成正比。

6、NADPH-細(xì)胞色素C還原酶的活性隨農(nóng)藥濃度的升高而下降，整體表現(xiàn)為與濃度成反比。而細(xì)胞色素b5則未表現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。同時(shí)室溫(25±1)℃下掃描不同時(shí)間的細(xì)胞色素P450CO結(jié)合光譜，結(jié)果表明：微粒體粗提液室溫(25±1)℃保存200min后，細(xì)胞色素P450全部轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞色素P420。 3.小白菜CAT、GSH對甲胺磷脅迫應(yīng)答的半定量RT-PCR檢測 根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，挑選兩種較敏感的生物標(biāo)志物CAT、GS

7、H，研究了甲胺磷誘導(dǎo)下二者的mRNA表達(dá)豐度的變化。在4.8g/L的高濃度甲胺磷誘導(dǎo)96小時(shí)后，提取小白菜葉片RNA，通過半定量RT-PCR檢測了目的基因的表達(dá)情況。紫外分光分析表明該方法提取RNA的純度較高，電泳檢測顯示RNA的完整性較好。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，顯示小白菜CAT在轉(zhuǎn)錄水平受到甲胺磷刺激后顯著上調(diào)，而GSH則顯著下調(diào)；與前文酶學(xué)研究結(jié)果一致。提示小白菜的這2個(gè)基因?qū)装妨椎膽?yīng)答較迅速，可以作為其早期暴露的生物標(biāo)志