廣西百色馬的分子系統(tǒng)進(jìn)化和體型性狀相關(guān)基因多態(tài)性的研究.pdf

1、本研究以廣西百色馬中的德保矮馬和土山馬，以及新疆伊犁馬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。采用分段克隆技術(shù)，測(cè)定德保矮馬線粒體基因組核苷酸全序列，并分析其基因的組成；利用PCR—RFLP技術(shù)和直接測(cè)序方法，研究百色馬的遺傳多樣性，以及其母系起源和分化；克隆百色馬的生長(zhǎng)激素(GH)基因，分析其結(jié)構(gòu)組成，并預(yù)測(cè)GH的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用PCR—SSCP技術(shù)研究以上3種類型馬的GH基因及其受體(GHR)基因的遺傳多態(tài)性，運(yùn)用一般線性模型(GLM)和方差分析，研究多態(tài)位點(diǎn)

2、基因型對(duì)馬體型性狀的影響程度。結(jié)果如下：
　　 1.德保矮馬線粒體基因組核苷酸全序列的測(cè)定。結(jié)果表明：成功地從德保矮馬的外周血液中純化出了線粒體DNA(mtDNA)；依此為模板，分段克隆出16段mtDNA片段，拼接后獲得了德保矮馬的mtDNA全序列，全長(zhǎng)16654bp，GenBank登錄號(hào)為EU939445；像其它哺乳動(dòng)物的一樣，德保矮馬mtDNA富含堿基A、T，A+T占58.02％；它完整地包含13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、2個(gè)核糖體

3、RNA亞基、22個(gè)tRNA和一個(gè)控制區(qū)(D—Loop)；蛋白質(zhì)編碼基因在密碼子使用上具有一定的偏性：推測(cè)22個(gè)tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)呈典型的或近似的三葉草狀；mtDNA D—Loop區(qū)包含2個(gè)擴(kuò)展終止序列(ETAS1/2)、1個(gè)中央保守區(qū)(CD)、3個(gè)保守序列盒(CSB1/2/3)、1段重復(fù)序列(RS)，RS由28個(gè)ACCTGTGC短片段串聯(lián)形成。
　　 2.利用PCR—RFLP技術(shù)和直接測(cè)序方法研究百色馬mtDNA D—Loop區(qū)

4、段的多態(tài)性，探討百色馬的遺傳多樣性和其母系起源、分化。結(jié)果表明：
　　 (1)利用9種限制性內(nèi)切酶對(duì)235匹德保矮馬和75匹土山馬的D—Loop全序列進(jìn)行酶切多態(tài)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有5種內(nèi)切酶表現(xiàn)出單酶切多態(tài)性；綜合分析單酶切圖譜，德保矮馬D—Loop序列被分類為22個(gè)單倍型，GenBank登錄號(hào)為FJ392562～FJ392580、GQ203125～GQ203127，土山馬包含19個(gè)單倍型，GenBank登錄號(hào)為GQ20312

5、8～GQ203144、GQ222059～GQ222060；德保矮馬和土山馬的單倍型多樣度(h)分別為0.8604和0.9005，兩者具有比較豐富的遺傳多樣性。
　　 (2)PCR產(chǎn)物直接測(cè)序分析德保矮馬、土山馬和伊犁馬的mtDNA D—Loop上游高變區(qū)序列(HVS)的多態(tài)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，德保矮馬和土山馬均各表現(xiàn)出26個(gè)單倍型，伊犁馬包含19種單倍型，單倍型多樣度(h)分別為0.907、0.950和0.894，核苷酸多樣度分別為1

6、.651％、2.105％和1.999％；中性檢驗(yàn)表明，德保矮馬的分子進(jìn)化偏離了中性模型，而土山馬和伊犁馬遵循中性模型；聚類分析發(fā)現(xiàn)，11個(gè)中國(guó)地方品種馬156個(gè)單倍型主要集中于A、D、F、C等4個(gè)支系，A為主要支系；構(gòu)建中國(guó)地方品種馬的NJ、MP、ML等3種親緣進(jìn)化樹，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)一致，支持家馬的多母系起源學(xué)說(shuō)。
　　 (3)德保矮馬和土山馬的遺傳距離值為0.024，兩者的分化時(shí)間大約發(fā)生在29.63萬(wàn)年以前；結(jié)果分析認(rèn)為，德保矮馬

7、和西南馬的起源、進(jìn)化線路重疊；人為的選種選配是造成德保矮馬分子進(jìn)化偏離中性模型的主要原因。
　　 3.百色馬GH基因的克隆及結(jié)構(gòu)分析，并采用PCR—SSCP技術(shù)研究德保矮馬、土山馬和伊犁馬等3種類型馬GH基因的多態(tài)性，結(jié)果表明：
　　 (1)成功克隆了德保矮馬和土山馬的GH基因的DNA序列，全長(zhǎng)1922bp，包括完整的5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，GenBank登錄號(hào)分別為EU939446和FJ604598。德保矮馬和土山馬的

8、GH基因序列同源性為99.6％，存在3個(gè)位點(diǎn)的堿基差異，其中前兩個(gè)位點(diǎn)為無(wú)義突變，第1739位點(diǎn)的堿基差異引起GH第185位氨基酸的差異，即Arg(AGG)←→Gly(GGG)?；贕H基因構(gòu)建不同種類動(dòng)物的親緣系統(tǒng)進(jìn)化樹，表明GH基因在物種進(jìn)化中比較保守。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)推測(cè)發(fā)現(xiàn)，百色馬GH基因共編碼216個(gè)氨基酸，其中前26個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，后190個(gè)氨基酸為成熟肽；馬的GH為全a型蛋白，包括4個(gè)螺旋，包含2個(gè)二硫鍵。
　　

9、(2)利用PCR—SSCP技術(shù)對(duì)GH基因4個(gè)片段進(jìn)行多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)：只有exon5片段表現(xiàn)出基因型多態(tài)性，即AA、BB和AB型，純合子序列之間存在兩個(gè)位點(diǎn)的堿基連鎖差異；等位基因A和B的基因頻率接近0.5，在這3種類型馬群體中分布均勻，此多態(tài)位點(diǎn)屬中度多態(tài)，處于非平衡狀態(tài)。統(tǒng)計(jì)分析表明，GH基因exon5多態(tài)位點(diǎn)的基因型對(duì)3種類型馬的體型性狀指數(shù)的影響不顯著(p>0.05)。
　　 4.利用PCR.SSCP技術(shù)研究3種類型馬GH

10、R基因9個(gè)外顯子序列的多態(tài)性，分析多態(tài)位點(diǎn)基因型對(duì)馬體型性狀的影響程度。結(jié)果表明：
　　 (1)對(duì)GHR基因的9個(gè)外顯子片段的PCR產(chǎn)物SSCP分析發(fā)現(xiàn)，exon1、exon3和exon5等3個(gè)片段表現(xiàn)出多態(tài)性，其它6個(gè)片段無(wú)多態(tài)性。在3種類型馬群體中，exon1片段SSCP分析表現(xiàn)出3種基因型AA、GG和AG型，OG型為優(yōu)勢(shì)基因型，G為優(yōu)勢(shì)等位基因；exon3片段在德保矮馬和土山馬表現(xiàn)出4種基因型，即AA、AC、GA和GC，G

11、A為優(yōu)勢(shì)基因型，A、G為優(yōu)勢(shì)等位基因，而伊犁馬的exon3片段無(wú)多態(tài)性；exon5片段在3種類型馬中表現(xiàn)出3種基因型，即AA、AG和GG型，GG為優(yōu)勢(shì)基因型，G為優(yōu)勢(shì)等位基因。exon1片段多態(tài)位點(diǎn)在德保矮馬和伊犁馬中為中度多態(tài)，而在土山馬中為低度多態(tài)；exon3片段多態(tài)位點(diǎn)在德保矮馬和土山馬中為中度多態(tài)，而在伊犁馬為單態(tài)；exon5片段多態(tài)位點(diǎn)在3種類型馬中均表現(xiàn)為中度多態(tài)。Hardy—Weinberg平衡檢驗(yàn)表明，在3種類型馬群體中

12、，exon1和exon3片段多態(tài)位點(diǎn)處于非平衡狀態(tài)，exon5多態(tài)位點(diǎn)處于平衡狀態(tài)。
　　 (2)分析GHR基因3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)基因型對(duì)馬體型性狀指數(shù)影響程度發(fā)現(xiàn)，exon1和exon5多態(tài)位點(diǎn)基因型對(duì)3種類型馬的體型性狀影響未達(dá)到顯著水平(p>0.05)；exon3多態(tài)位點(diǎn)基因型對(duì)德保矮馬的體高和體長(zhǎng)有顯著性影響，AC基因型的平均體高和體長(zhǎng)顯著高于其它基因型(p<0.05)，GC基因型的體型性狀指數(shù)均低于其它基因型，擁有G等位基因

13、的群體的平均體高、體長(zhǎng)、胸圍均比較小；二連組合效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，G3C3G5G5與矮馬的體型矮小顯著相關(guān)(p<0.05)，相反，A3C3GsG5與矮馬的體型高大密切相關(guān)(p<0.05)。三連組合效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，具有G1G1G3C3G5G5三連組合的德保矮馬的體長(zhǎng)、胸圍均明顯小于其它組合(p<0.05)，且體高比較低。綜合分析發(fā)現(xiàn)，GHR基因的3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)之間不存在互作效應(yīng)，exon3片段GC基因型是顯著影響德保矮馬體型性狀的主要基因型，可以作