SlCycB2調控植物多細胞表皮毛形成和花器發(fā)育的機制研究.pdf

1、植物表皮毛對抵御生物和非生物逆境具有重要作用，同時也是一種研究植物細胞命運調控的模式系統(tǒng)。擬南芥單細胞表皮毛形成受到MYB/bHLH/WD蛋白復合體的調控，該復合體通過激活下游表皮毛起始關鍵基因的表達，導致表皮細胞膨大而異化成表皮毛。番茄、煙草等多細胞表皮毛的調控機制不同于單細胞表皮毛。到目前為止，番茄、煙草等多細胞表皮毛的形成機制尚未被揭示。表皮毛的形成離不開細胞周期的調控，細胞周期蛋白在不同細胞周期的轉變過程中起到重要作用?；ㄆ鞴侔l(fā)

2、育的研究具有重要的生物學意義，目前確定ABCDE模型可以用來揭示花器官形成調控機理。但是，本研究中的新型B型細胞周期蛋白是否參與花器官形成的調控還未可知。
　　本研究主要對SlCycB2基因在番茄、煙草和擬南芥中的同源基因進行了鑒定，并在番茄和煙草中進行了功能分析。主要的結果如下:
　　1.利用SlCycB2基因編碼的氨基酸序列在SGN、TAIR和NCBI等數(shù)據庫中篩選同源基因。在番茄中確定2個同源基因，命名為SlCycB3

3、和SlCycB4;在煙草中確定3個同源基因，分別命名為NtCycB2、NtCycB3和NtCycB4;在擬南芥中確定2個同源基因，命名為AtCycB2和AtCycB3。一級結構分析發(fā)現(xiàn)這類基因均只有一個外顯子，編碼100多個氨基酸，具有三個保守區(qū)。將該類基因與番茄、煙草和擬南芥中的功能已知的B型細胞周期蛋白進行系統(tǒng)進化樹分析，結果顯示它們是一類新型的B型細胞周期蛋白。
　　2.利用番茄、煙草和擬南芥中SlCycB2的同源基因所編碼

4、氨基酸序列在NCBI中進行Protein Blast分析，確定不同物種均含有SlCycB2的同源基因，且功能未知。該結果表明SlCycB2基因以及在不同物種的同源基因可能具有重要的生物學功能。
　　3.SlCycB2和SlCycB3的組織表達譜分析結果顯示這兩個基因在番茄各個組織中都有表達，在花和葉中的表達最高。亞細胞定位分析確定SlCycB2所編碼蛋白定位于細胞核中。SlCycB2基因啟動子序列分析發(fā)現(xiàn)其中有多個光響應元件。對栽

5、培番茄Ailsa Craig進行光照和暗處理，測定SlCycB2和SlCycB3基因的表達量，結果顯示二者均受到光的誘導，受到暗條件的抑制。構建SlCycB2基因啟動子驅動GUS-YFP融合表達載體，轉化番茄并分析該基因的表達特點，實驗結果表明該基因在下胚軸、莖表皮毛、葉表皮毛、花中的柱頭和未成熟的果實中都有表達，且在表皮毛的腺體中高表達。
　　4.轉基因功能分析確定SlCycB2基因參與調控番茄表皮毛的形成。SlCycB2超量表

6、達載體和RNAi抑制表達載體分別導入到栽培番茄AC獲得轉基因植株。qRT-PCR分析結果顯示SlCycB2基因的表達水平在超量表達轉基因植株中顯著上調，而在抑制表達轉基因植株中顯著下調。SlCycB2超量表達植株中表皮毛密度顯著減少，非腺體毛和Ⅰ型腺體毛幾乎消失，Ⅵ和Ⅶ型腺體毛的密度顯著降低。而在SlCycB2-RNAi抑制表達植株上表皮毛密度顯著增加，且主要是Ⅲ型和Ⅴ型非腺體毛顯著增加，而且莖上形成了Ⅲtype-like超長毛，其他類

7、型的表皮毛沒有明顯變化。
　　5.SlCycB2超量表達植株葉片萜類含量的測定結果顯示與對照AC相比，SlCycB2超量表達植株葉片中萜類化合物（包括單萜和倍半萜）的含量極顯著降低。萜類化合物對生物具有重要的防御作用。因此，分析了轉基因材料對斜紋夜蛾的抗性實驗，結果表明SlCycB2超量表達植株更易遭受斜紋夜蛾的啃食。綜合這些結果，推測SlCycB2基因可能通過調控Ⅵ型表皮毛的形成，影響萜類物質的生物合成，進而影響其生物防御的效果

8、。
　　6.轉基因功能分析還表明SlCycB2基因調控番茄花器官的發(fā)育。SlCycB2超量表達植株表現(xiàn)出花藥開裂，花柱變短的表型，坐果率顯著降低。SEM觀察發(fā)現(xiàn)畸形花粉顯著增加，花柱細胞變短和柱頭乳突細胞畸形。實驗結果表明SlCycB2參與調控番茄花柱和花粉的發(fā)育。
　　7.RNA-seq分析結果表明，SlCycB2超量表達植株和對照AC植株之間具有241個差異表達基因(DEGs); SlCycB2-RNAi抑制表達植株和對

9、照AC之間有84個差異表達的基因;SlCycB2超量表達植株和SlCycB2 RNAi植株之間有834個差異表達基因。對DEGs進行功能聚類分析，發(fā)現(xiàn)這些DEGs主要參與萜類代謝、角質蠟質合成和蛋白酶抑制因子的合成等途徑。這暗示了SlCycB2超量表達植物中次生代謝物（如萜類化合物）的減少導致其對食草性昆蟲的防御力減弱。
　　8.轉基因分析結果顯示SlCycB2在不同物種的同源基因具有相同的多細胞表皮毛調控功能。利用pMV2載體構

10、建了SlCycB3、SlCycB4、NtCycB2、NtCycB3、NtCycB4、AtCycB2和AtCycB3基因的超量表達載體，利用pHELLSGATE2構建了SlCycB3和SlCycB4的RNAi抑制表達載體，遺傳轉化獲得轉基因植株。利用qRT-PCR和RT-PCR檢測目的基因的表達水平，確定這幾個基因在超量表達植株中均上調表達;SlCycB3和SlCycB4在RNAi抑制表達植株中均下調表達。表型分析發(fā)現(xiàn)SlCycB3、At

11、CycB2和NtCycB2超量表達轉基因植株的表皮毛密度顯著減少;SlCycB3-RNAi抑制表達植株的表皮毛密度顯著增加，說明這類基因具有相同的多細胞表皮毛調控功能。
　　9.SlCycB2、SlCycB3、NtCycB2和AtCycB2超量表達番茄植株中SlCycB2和SlCycB3的表達量進行測定，結果顯示在NtCycB2和AtCycB2超量表達轉基因番茄植株中SlCycB2和SlCycB3基因都下調表達;在SlCycB3超

12、量表達番茄植株中SlCycB2基因亦下調表達;同樣，在SlCycB2超量表達植株中SlCycB3也下調表達。推測這類基因可能受其同源基因的表達水平的影響。
　　10.構建的SlCycB3、SlCycB4、tCycB2、NtCycB3、NtCycB4、AtCycB2和AtCycB3超量表達載體遺傳轉化煙草獲得轉基因植株。表型分析確定SlCycB2、SlCycB3、AtCycB2和NtCycB2轉基因植株的表皮毛密度顯著降低，而SlC