SlCycB2調(diào)控植物多細(xì)胞表皮毛形成和花器發(fā)育的機(jī)制研究.pdf

1、植物表皮毛對(duì)抵御生物和非生物逆境具有重要作用，同時(shí)也是一種研究植物細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控的模式系統(tǒng)。擬南芥單細(xì)胞表皮毛形成受到MYB/bHLH/WD蛋白復(fù)合體的調(diào)控，該復(fù)合體通過(guò)激活下游表皮毛起始關(guān)鍵基因的表達(dá)，導(dǎo)致表皮細(xì)胞膨大而異化成表皮毛。番茄、煙草等多細(xì)胞表皮毛的調(diào)控機(jī)制不同于單細(xì)胞表皮毛。到目前為止，番茄、煙草等多細(xì)胞表皮毛的形成機(jī)制尚未被揭示。表皮毛的形成離不開(kāi)細(xì)胞周期的調(diào)控，細(xì)胞周期蛋白在不同細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)變過(guò)程中起到重要作用?；ㄆ鞴侔l(fā)

2、育的研究具有重要的生物學(xué)意義，目前確定ABCDE模型可以用來(lái)揭示花器官形成調(diào)控機(jī)理。但是，本研究中的新型B型細(xì)胞周期蛋白是否參與花器官形成的調(diào)控還未可知。
　　本研究主要對(duì)SlCycB2基因在番茄、煙草和擬南芥中的同源基因進(jìn)行了鑒定，并在番茄和煙草中進(jìn)行了功能分析。主要的結(jié)果如下:
　　1.利用SlCycB2基因編碼的氨基酸序列在SGN、TAIR和NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選同源基因。在番茄中確定2個(gè)同源基因，命名為SlCycB3

3、和SlCycB4;在煙草中確定3個(gè)同源基因，分別命名為NtCycB2、NtCycB3和NtCycB4;在擬南芥中確定2個(gè)同源基因，命名為AtCycB2和AtCycB3。一級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)這類(lèi)基因均只有一個(gè)外顯子，編碼100多個(gè)氨基酸，具有三個(gè)保守區(qū)。將該類(lèi)基因與番茄、煙草和擬南芥中的功能已知的B型細(xì)胞周期蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果顯示它們是一類(lèi)新型的B型細(xì)胞周期蛋白。
　　2.利用番茄、煙草和擬南芥中SlCycB2的同源基因所編碼

4、氨基酸序列在NCBI中進(jìn)行Protein Blast分析，確定不同物種均含有SlCycB2的同源基因，且功能未知。該結(jié)果表明SlCycB2基因以及在不同物種的同源基因可能具有重要的生物學(xué)功能。
　　3.SlCycB2和SlCycB3的組織表達(dá)譜分析結(jié)果顯示這兩個(gè)基因在番茄各個(gè)組織中都有表達(dá)，在花和葉中的表達(dá)最高。亞細(xì)胞定位分析確定SlCycB2所編碼蛋白定位于細(xì)胞核中。SlCycB2基因啟動(dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn)其中有多個(gè)光響應(yīng)元件。對(duì)栽

5、培番茄Ailsa Craig進(jìn)行光照和暗處理，測(cè)定SlCycB2和SlCycB3基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示二者均受到光的誘導(dǎo)，受到暗條件的抑制。構(gòu)建SlCycB2基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS-YFP融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化番茄并分析該基因的表達(dá)特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該基因在下胚軸、莖表皮毛、葉表皮毛、花中的柱頭和未成熟的果實(shí)中都有表達(dá)，且在表皮毛的腺體中高表達(dá)。
　　4.轉(zhuǎn)基因功能分析確定SlCycB2基因參與調(diào)控番茄表皮毛的形成。SlCycB2超量表

6、達(dá)載體和RNAi抑制表達(dá)載體分別導(dǎo)入到栽培番茄AC獲得轉(zhuǎn)基因植株。qRT-PCR分析結(jié)果顯示SlCycB2基因的表達(dá)水平在超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中顯著上調(diào)，而在抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中顯著下調(diào)。SlCycB2超量表達(dá)植株中表皮毛密度顯著減少，非腺體毛和Ⅰ型腺體毛幾乎消失，Ⅵ和Ⅶ型腺體毛的密度顯著降低。而在SlCycB2-RNAi抑制表達(dá)植株上表皮毛密度顯著增加，且主要是Ⅲ型和Ⅴ型非腺體毛顯著增加，而且莖上形成了Ⅲtype-like超長(zhǎng)毛，其他類(lèi)

7、型的表皮毛沒(méi)有明顯變化。
　　5.SlCycB2超量表達(dá)植株葉片萜類(lèi)含量的測(cè)定結(jié)果顯示與對(duì)照AC相比，SlCycB2超量表達(dá)植株葉片中萜類(lèi)化合物（包括單萜和倍半萜）的含量極顯著降低。萜類(lèi)化合物對(duì)生物具有重要的防御作用。因此，分析了轉(zhuǎn)基因材料對(duì)斜紋夜蛾的抗性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明SlCycB2超量表達(dá)植株更易遭受斜紋夜蛾的啃食。綜合這些結(jié)果，推測(cè)SlCycB2基因可能通過(guò)調(diào)控Ⅵ型表皮毛的形成，影響萜類(lèi)物質(zhì)的生物合成，進(jìn)而影響其生物防御的效果

8、。
　　6.轉(zhuǎn)基因功能分析還表明SlCycB2基因調(diào)控番茄花器官的發(fā)育。SlCycB2超量表達(dá)植株表現(xiàn)出花藥開(kāi)裂，花柱變短的表型，坐果率顯著降低。SEM觀察發(fā)現(xiàn)畸形花粉顯著增加，花柱細(xì)胞變短和柱頭乳突細(xì)胞畸形。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SlCycB2參與調(diào)控番茄花柱和花粉的發(fā)育。
　　7.RNA-seq分析結(jié)果表明，SlCycB2超量表達(dá)植株和對(duì)照AC植株之間具有241個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs); SlCycB2-RNAi抑制表達(dá)植株和對(duì)

9、照AC之間有84個(gè)差異表達(dá)的基因;SlCycB2超量表達(dá)植株和SlCycB2 RNAi植株之間有834個(gè)差異表達(dá)基因。對(duì)DEGs進(jìn)行功能聚類(lèi)分析，發(fā)現(xiàn)這些DEGs主要參與萜類(lèi)代謝、角質(zhì)蠟質(zhì)合成和蛋白酶抑制因子的合成等途徑。這暗示了SlCycB2超量表達(dá)植物中次生代謝物（如萜類(lèi)化合物）的減少導(dǎo)致其對(duì)食草性昆蟲(chóng)的防御力減弱。
　　8.轉(zhuǎn)基因分析結(jié)果顯示SlCycB2在不同物種的同源基因具有相同的多細(xì)胞表皮毛調(diào)控功能。利用pMV2載體構(gòu)

10、建了SlCycB3、SlCycB4、NtCycB2、NtCycB3、NtCycB4、AtCycB2和AtCycB3基因的超量表達(dá)載體，利用pHELLSGATE2構(gòu)建了SlCycB3和SlCycB4的RNAi抑制表達(dá)載體，遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株。利用qRT-PCR和RT-PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平，確定這幾個(gè)基因在超量表達(dá)植株中均上調(diào)表達(dá);SlCycB3和SlCycB4在RNAi抑制表達(dá)植株中均下調(diào)表達(dá)。表型分析發(fā)現(xiàn)SlCycB3、At

11、CycB2和NtCycB2超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的表皮毛密度顯著減少;SlCycB3-RNAi抑制表達(dá)植株的表皮毛密度顯著增加，說(shuō)明這類(lèi)基因具有相同的多細(xì)胞表皮毛調(diào)控功能。
　　9.SlCycB2、SlCycB3、NtCycB2和AtCycB2超量表達(dá)番茄植株中SlCycB2和SlCycB3的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示在NtCycB2和AtCycB2超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因番茄植株中SlCycB2和SlCycB3基因都下調(diào)表達(dá);在SlCycB3超

12、量表達(dá)番茄植株中SlCycB2基因亦下調(diào)表達(dá);同樣，在SlCycB2超量表達(dá)植株中SlCycB3也下調(diào)表達(dá)。推測(cè)這類(lèi)基因可能受其同源基因的表達(dá)水平的影響。
　　10.構(gòu)建的SlCycB3、SlCycB4、tCycB2、NtCycB3、NtCycB4、AtCycB2和AtCycB3超量表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化煙草獲得轉(zhuǎn)基因植株。表型分析確定SlCycB2、SlCycB3、AtCycB2和NtCycB2轉(zhuǎn)基因植株的表皮毛密度顯著降低，而SlC