李屬(PRUNUS)植物自交親和性及S基因進(jìn)化機(jī)制的研究.pdf

1、本研究以中國(guó)櫻桃(Prunus pseudocerasus)、甜櫻桃(P.avium)、日本櫻花(P。speciosa)和杏(P.armeniaca)品種及部分的自交和雜交后代個(gè)體為試驗(yàn)材料，在鑒定這些品種自交親和特性的基礎(chǔ)上，克隆出了花柱和花粉自交不親和性決定因子，以及部分品種的S基因型，并對(duì)中國(guó)櫻桃自交親和性和李屬植物S等位基因進(jìn)化機(jī)理展開了相關(guān)的研究，取得的主要結(jié)果如下：
　　 一、對(duì)9個(gè)中國(guó)櫻桃品種進(jìn)行了人工自花授粉試驗(yàn)

2、，采取花柱固定、苯胺藍(lán)熒光染色后，用熒光顯微鏡觀察了授粉72h后花柱內(nèi)花粉管生長(zhǎng)情況，并在果實(shí)成熟前對(duì)授粉坐果率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。試驗(yàn)結(jié)果表明，9個(gè)中國(guó)櫻桃品種均表現(xiàn)出了很強(qiáng)的自交親和性；授粉72h后，多數(shù)花粉管能夠生長(zhǎng)至花柱的基部。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中國(guó)櫻桃屬于配子體型自交親和性果樹。對(duì)這些中國(guó)櫻桃的倍性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，它們都是多倍體植株，每個(gè)植株中至少含有2個(gè)不同的S等位基因。
　　 二、采用李屬S-RNase基因特異性保守引物進(jìn)行PC

3、R和RT-PCR，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序和序列比對(duì)，在中國(guó)櫻桃的14個(gè)品種中獲得了10個(gè)不同的花柱S-RNase基因，同時(shí)鑒定了9個(gè)品種的花柱S基因型。這些S-RNase基因推導(dǎo)氨基酸序列間的同源性在69.4～84.3％之間，與其它李屬物種S-RNase基因的同源性在65.31～100％之間。種間氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，5個(gè)中國(guó)櫻桃S-RNase基因與日本櫻花等其它李屬物種S-RNase基因序列同源性高出97％，它們所含有的第一內(nèi)含子和

4、第二內(nèi)含子序列間也存在極高的相似性。采用李屬SFB基因特異性保守引物進(jìn)行RT-PCR，從7個(gè)中國(guó)櫻桃品種擴(kuò)增出4種不同的并且在花粉中特異表達(dá)的花粉SFB基因，它們推導(dǎo)氨基酸序列間的同源性在76.9～80.0％之間且與它們的S-RNase基因呈緊密連鎖關(guān)系。種間序列同源性比較發(fā)現(xiàn)，中國(guó)櫻桃的SFB基因同樣與其它李屬物種SFB基因序列間存在極高相似性，中國(guó)櫻桃SFB1和梅SLF9基因以及中國(guó)櫻桃SFB5和黑刺李SFB16基因間序列同源性均高

5、出96％。
　　 三、利用甜櫻桃和中國(guó)櫻桃雜交的可親和性，通過花柱S-RNase基因和花粉SFB基因特異保守引物的PCR擴(kuò)增鑒定了雜交后代個(gè)體的S基因型，從而確定了四倍體中國(guó)櫻桃S基因在花粉粒中的分布及初步的遺傳方式。對(duì)中國(guó)櫻桃自交和雜交后代個(gè)體S基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)變異的花粉SFB基因的累積并不是造成中國(guó)櫻桃自交親和的關(guān)鍵原因，‘競(jìng)爭(zhēng)作用’才是主導(dǎo)因素。此外，研究發(fā)現(xiàn)，同一中國(guó)櫻桃品種的單個(gè)和組對(duì)S基因在自交與雜交后代中的分布都

6、不均衡，說明不同的花粉粒對(duì)同一母本花柱的親和性大小不一致，同一花粉粒對(duì)不同母本花柱的親和性也不相同。這些結(jié)果表明中國(guó)櫻桃花粉粒與母本花柱的親和性或是花粉管在花柱中生長(zhǎng)時(shí)受到了來自花柱或子房中調(diào)控因子的影響。
　　 四、以中國(guó)櫻桃品種存在的極高種間同源性的花柱S-RNase基因和花粉SFB基因?yàn)榛A(chǔ)，從2株中國(guó)櫻桃野生品種和2株日本櫻花品種中共克隆出了8個(gè)花柱S-RNase基因和8個(gè)花粉SFB基因及一個(gè)中國(guó)櫻桃SFB-like基因

7、，其中4個(gè)S-RNase基因和1個(gè)SFB基因與其它李屬S基因序列的同源性極高。這些同源性極高的李屬S基因序列系統(tǒng)比較的結(jié)果，進(jìn)一步支持了李屬S-RNase基因的進(jìn)化是在各物種分化之前的假說。將花柱S-RNase基因與花粉SFB基因序列的同源性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)花粉SFB基因序列多態(tài)性小于花柱S-RNase基因，且它們?cè)诟髯韵到y(tǒng)樹中的分布也不一致，說明了花粉SFB基因比花柱S-RNase基因起源晚，在共同演化的過程中，存在獨(dú)自進(jìn)化現(xiàn)象。

8、>　　 五、以北美杏'Hercot'和中國(guó)杏‘串枝紅’為材料，依據(jù)種內(nèi)品種間的雜交可親和性，對(duì)同源性極高的S4和S24單元型中花柱和花粉S基因的功能分別進(jìn)行驗(yàn)證。統(tǒng)計(jì)的坐果率和72h后花粉管在花柱中的生長(zhǎng)狀況說明這兩個(gè)杏品種均表現(xiàn)出自交不親和性和雜交可親和性。進(jìn)一步對(duì)相互雜交后代個(gè)體的S基因型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)父本中的S24和S4單元型都不能遺傳給雜交后代，表明S4-RNase和S24-RNase分別可以拒絕接受基因型為S24和S4的花粉