梨自交親和性變異的分子機(jī)理研究.pdf

1、本文以?shī)W嗄二十世紀(jì)、金墜梨及大果黃花3個(gè)自交親和性突變品種為試材，應(yīng)用現(xiàn)代分子生物技術(shù)等手段，研究了突變品種及其原始品種授粉生物學(xué)特性、S-RNase基因型、S-RNase基因的表達(dá)以及在后代中的分離規(guī)律等，主要的結(jié)果如下：
　　 1.奧嗄二十世紀(jì)自交親和性突變的分子機(jī)制
　　 田間授粉結(jié)果表明奧嗄二十世紀(jì)及其后代秋榮和54S-135自花授粉能夠結(jié)實(shí)，座果率達(dá)88％以上，為自交親和性品種，而它的原始品種二十世紀(jì)自花授粉結(jié)

2、實(shí)率低，僅有7％，表現(xiàn)自交不親和性。而在相互授粉時(shí)，奧嗄二十世紀(jì)雌蕊接受二十世紀(jì)和54S-135的花粉而受精結(jié)實(shí)，但二十世紀(jì)雌蕊拒絕奧嗄二十世紀(jì)和54S-135的花粉，證實(shí)奧嗄二十世紀(jì)僅是雌蕊發(fā)生自交親和性突變（S2S4SM，SM=stylar-part mutant，花柱突變體），花粉與其原始品種一樣，自交不親和性功能正常。
　　 PCR檢測(cè)供試品種花柱S-RNase基因的結(jié)果顯示，奧嗄二十世紀(jì)的花柱S2-RNase基因與其原

3、始品種二十世紀(jì)完全一樣，而S4-RNase基因比其原始品種二十世紀(jì)的少，并在花柱中正常轉(zhuǎn)錄；而且，IEF-PAGE也檢測(cè)到奧嗄二十世紀(jì)花柱中微量的S4-RNase蛋白，并且在柱頭上的表達(dá)量與二十世紀(jì)的無(wú)明顯差異，表明S4-RNase基因確實(shí)在奧嗄二十世紀(jì)基因組中存在并在柱頭上正常表達(dá)。但是在其后代基因組中不能檢測(cè)到S4-RNase基因，也不能檢測(cè)到S4-RNase mRNA和S4-RNase蛋白，表明奧嗄二十世紀(jì)中少量的花柱S4-RNa

4、se基因不能遺傳給后代。從奧嗄二十世紀(jì)的自交后代中S-Rase基因的分離特性來(lái)看，S2S4SM和S4SMS4SM分離比例為1:1，從分子水平印證了與前人的結(jié)果。
　　 本研究的結(jié)果認(rèn)為奧嗄二十世紀(jì)含有少量的S4-RNase基因，并在柱頭上正常表達(dá)，但是不能遺傳給后代，含有S4SM等位基因的后代S4-RNase基因缺失，表現(xiàn)自交親和。
　　 2.金墜梨自花授粉結(jié)實(shí)的機(jī)制
　　 田間授粉試驗(yàn)結(jié)果顯示，鴨梨自花結(jié)實(shí)率僅

5、2％，自花花粉管在花柱中上部已經(jīng)停止生長(zhǎng)，而金墜梨自花結(jié)實(shí)率高達(dá)76％，自花花粉能正常生長(zhǎng)至花柱基部：相互授粉時(shí)發(fā)現(xiàn)，鴨梨花柱能夠接收金墜梨花粉并受精結(jié)實(shí)，而金墜梨花柱卻與鴨梨花粉雜交不親和。這些結(jié)果初步表明金墜花柱自交不親和性功能正常，而花粉發(fā)生變異。
　　 鴨梨和金墜梨基于S-RNase基因的S基因型完全一致，均為S21S34；進(jìn)一步克隆兩品種S-RNase基因cDNA全長(zhǎng)序列，并進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示，該兩品種的1對(duì)雌蕊S

6、-RNase基因在核苷酸序列上完全相同；RT-PCR分析結(jié)果表明，兩個(gè)品種的1對(duì)S-RNase基因均正常表達(dá)，表達(dá)量也沒有明顯差異，從分子水平上證實(shí)了金墜梨在花柱方面和鴨梨并無(wú)差異，而是花粉自交不親和性功能發(fā)生變異，導(dǎo)致了自交不親和性功能的喪失，表現(xiàn)出自花授粉能夠結(jié)實(shí)。
　　 進(jìn)一步分析金墜梨自交后代中S-RNase基因的分布，結(jié)果顯示，在17個(gè)后代中均能檢測(cè)出S34-RNase基因，但是只在8個(gè)后代中檢測(cè)到S21-RNase基

7、因，因此這8個(gè)后代居于S-RNase的S基因型與其親本一樣為雜合體S21S34，而其余的9個(gè)后代則為S34純合體，即S34S34，而沒有發(fā)現(xiàn)S21S21純合體后代，S21S34：S34S34=8:9≈1:1。該結(jié)果表明，金墜梨的S21單元型花粉SI功能正常，只有S34單元型花粉發(fā)生變異，因而其S單元型應(yīng)該為S21S34PPM（PPM=pollen-part mutant，花粉突變體），但S34單元型花粉究竟究竟是如何突變，是由于兩個(gè)S單

8、元型花粉S基因發(fā)生異源二倍體化，即單個(gè)花粉中包含兩個(gè)不同S單元型的花粉S基因，從而因“競(jìng)爭(zhēng)型相互抑制”導(dǎo)致自交親和，還是因花粉S基因本身發(fā)生變異引起自交親和，需要等梨花粉S基因鑒定出來(lái)后，通過(guò)比較分析鴨梨和金墜梨兩者花粉S基因是否有差異，才能解開金墜梨自交親和性突變之謎，但決不是因染色體倍性的改變導(dǎo)致自交親和。
　　 3.大果黃花的自花授粉結(jié)實(shí)的機(jī)制
　　 田間授粉試驗(yàn)結(jié)果顯示，黃花梨自花授粉結(jié)實(shí)率僅為1.5％，屬于自交

9、不親和性品種；而大果黃花自花授粉的結(jié)實(shí)率高達(dá)60％，屬于自交親和性品種；相互授粉時(shí)，黃花×大果黃花組合的坐果率達(dá)70％，為雜交親和，但反交時(shí)坐果率為1％，表現(xiàn)為雜交不親和；熒光顯微鏡觀察這些組合授粉后花柱內(nèi)花粉管生長(zhǎng)情況，也得到相同的結(jié)果。這些結(jié)果表明，大果黃花雌蕊的自交不親和性性狀正常，但花粉發(fā)生突變。
　　 進(jìn)一步鑒定出了黃花和大果黃花基于S-RNase基因的S基因型，發(fā)現(xiàn)兩者一樣，均含有S1-RNase和S2-RNase基

10、因；該兩品種的這1對(duì)雌蕊S-RNase基因的DNA序列沒有差異，而且均是特異性地在花柱中表達(dá)，表達(dá)量也沒有明顯差異，表明大果黃花和黃花的花柱S-RNase基因并無(wú)差異，雌蕊自交不親和性功能均正常。
　　 染色體數(shù)目觀察結(jié)果顯示大果黃花有68條染色體，而它的原始品種黃花含有正常的34條染色體，表明大果黃花為黃花的四倍體芽變，因而S基因型應(yīng)該為S1S1S2S2。
　　 進(jìn)一步調(diào)查大果黃花自交后代S基因型，未發(fā)現(xiàn)S1S1S1S

11、1和S2S2S2S2的純和體后代，S1S1S1S2、S1S1S2S2和S1S2S2S2分離比例為6:15:6≈1:2:1，表明只有雜合二倍體花粉（S1S2）才能克服自交不親和性，而純合二倍體花粉（S1S1和S2S2）仍然表現(xiàn)正常的自交不親和性，同時(shí)也表明兩個(gè)花粉S基因本身正常。
　　 所有這些證據(jù)表明，大果黃花的自交親和性變異，是因染色體數(shù)目加倍而產(chǎn)生雜合二倍體花粉，進(jìn)而導(dǎo)致了花粉自交不親和性功能的喪失，表現(xiàn)出自花授粉能夠結(jié)實(shí)，

12、但花柱自交不親和性功能以及花粉S基因本身正常。
　　 本研究結(jié)果進(jìn)一步闡明了雌蕊自交親和性突變品種奧嗄二十世紀(jì)S4-RNase基因的特性，首次澄清了國(guó)際上多年懸而未決的關(guān)于奧嗄二十世紀(jì)自交親和性突變的分子和遺傳機(jī)制，即S4-RNase基因以嵌合體的形式，但不能傳給后代。同時(shí)首次以兩個(gè)梨花粉自交親和性突變品種為試材，發(fā)現(xiàn)兩者雖然表型一致（即均是花粉SI功能喪失），但應(yīng)用兩種不同的策略打破自交不親和性，即大果黃花通過(guò)染色體加倍，產(chǎn)生