不同來源腸道沙門菌分離株流行病學(xué)分析及腸炎沙門菌macAB外排泵系統(tǒng)功能初步研究.pdf

1、沙門菌是最重要的食源性致病菌之一,能夠引起人和動物發(fā)熱、腸炎、敗血癥等多種疾病。食物鏈中污染了沙門菌會帶來高昂的醫(yī)療費用并且會導(dǎo)致生產(chǎn)力的降低,具有重要的經(jīng)濟影響。人類主要由于食用了污染的食物,尤其是動物源性食品或者與患病動物直接接觸而感染發(fā)病。近幾年來,由于抗生素在人和食源性動物上大量使用和濫用,沙門菌的耐藥率正逐漸提高。已有大量的文獻報道表明,從不同來源分離到的單重和多重耐藥沙門菌逐年增加,而且許多沙門菌的血清型中均出現(xiàn)了多重耐藥現(xiàn)

2、象。這些耐藥的沙門菌能夠通過食物鏈傳遞至人類,從而造成嚴重的公共衛(wèi)生問題。
　　 細菌耐藥是由耐藥基因調(diào)控的。已知的許多耐藥基因大多位于可移動元件如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子和基因島上。在抗生素選擇性壓力的作用下,細菌能夠通過可移動元件獲得耐藥基因,或者某些基因發(fā)生突變從而對抗生素產(chǎn)生耐藥性。多重耐藥細菌往往攜帶諸如整合子等基因元件。整合子位于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和基因組上,它們可以整合并且傳播大量的耐藥基因。Ⅰ類整合子是最常見的整合子,研究

3、表明,在世界上許多國家的多種沙門菌血清型中均能檢測到Ⅰ類整合子。其主要由3部分組成,兩端為高度保守片段,即5'CS和3'CS,中間的可變區(qū)為含有一個或多個耐藥基因的基因盒,但是有的I類整合子不存在基因盒。
　　 細菌外排泵系統(tǒng)能夠通過膜通道蛋白外排多種抗菌藥物,在細菌耐藥性方面具有重要的作用。近年來的研究表明,除了在細菌耐藥性上發(fā)揮作用外,外排泵系統(tǒng)和許多細菌的毒力有關(guān)。AcrAB外排泵系統(tǒng)是國內(nèi)外學(xué)者研究較多的外排泵系統(tǒng),沙門

4、菌AcrAB外排泵系統(tǒng)和細菌多重耐藥及致病性有關(guān)。近來的研究顯示,macAB外排泵系統(tǒng)介導(dǎo)鼠傷寒沙門菌對紅霉素的耐藥性。而進一步的研究表明,與其它外排泵分子的缺失株相比,macAB基因的缺失對鼠傷寒沙門菌的減毒作用最強。因此,有必要對腸炎沙門菌macAB外排泵系統(tǒng)在細菌耐藥和毒力方面的作用機制進行研究。
　　 1不同來源腸道沙門菌分離株流行病學(xué)分析
　　 2009-2010年間,采集華東地區(qū)雞源、鴨源、鵝源、豬源和人源樣

5、品2566份,共分離到135株沙門菌,樣品陽性率為5.3％。135株沙門菌包括lO種不同的血清型,常見血清型依次為山夫登堡沙門菌、腸炎沙門菌、雞白痢沙門菌和鼠傷寒沙門菌。應(yīng)用XbaⅠ對所有分離株進行PFGE分型分析,135株沙門菌共分為A-F6個遺傳譜系和47個PFGE帶型,相似度在36-100％之間。除了山夫登堡沙門菌、德爾卑沙門菌和圣保羅沙門菌外,PFGE帶型均按照血清型進行遺傳譜系的劃分。有些分離于不同區(qū)域和不同動物種類的紐波特沙

6、門菌相似度也非常高。PFGE結(jié)果表明,華東地區(qū)不同區(qū)域、不同源沙門菌和不同血清型沙門菌的PFGE帶型較復(fù)雜。
　　 對135株沙門菌分離株進行了18種抗生素藥敏分析、17種耐藥基因和Ⅰ類整合子的檢測。藥敏試驗的結(jié)果表明,菌株對羧芐西林、萘啶酸、磺胺異噁唑、氨芐西林和阿莫西林的耐藥率最高,分別為94.1％、45.2％、37％、31.9％和28.9％,菌株對環(huán)丙沙星均敏感?？偣灿?31(97％)株菌株至少對1種抗生素耐藥。135株菌

7、株共有32種不同的耐藥譜。雞源沙門菌和雞白痢沙門菌多重耐藥現(xiàn)象嚴重,多數(shù)對5種及以上抗生素耐藥。
　　 耐藥基因的檢測結(jié)果表明,blatem-1、blapse-1、sul2和tetA陽性率最高,分別為89.6％、55.6％、28.15％和20.7％,沒有檢測到blaCMY-2、blaCMY-9、tetC、tetG和flpR。除了氨基糖苷類外,其它種類抗生素耐藥表型的測定結(jié)果與耐藥基因基本一致。135株細菌中有17株攜帶Ⅰ類整合子

8、,陽性率為12.6％。含有Ⅰ類整合子菌株的血清型包括山夫登堡沙門菌、德爾卑沙門菌、雞白痢沙門菌和腸炎沙門菌。所有含有Ⅰ類整合子的菌株均攜帶int1和qacE△1-sulⅠ基因,其中有10株(7.4％)菌株含有大小為1 kb的整合子,其基因盒所含基因為aadA2,含有大小為600 bp整合子的菌株不攜帶基因盒。另外,沒有在同一株菌株中發(fā)現(xiàn)有2種不同的Ⅰ類整合子。
　　 2腸炎沙門菌macAB外排泵系統(tǒng)功能初步研究以腸炎沙門菌人源分

9、離株P(guān)O4基因組為模板,PCR擴增macAB基因的上下游同源臂,同時以質(zhì)粒pKD3為模板擴增氯霉素耐藥基因Cm。將這3個基因亞克隆至自殺性載體pGMB151,構(gòu)建重組自殺性載體pGMB151-△macAB/Cm。通過重組自殺性載體pGMB151-△macAB/Cm突變的macAB基因和腸炎沙門菌PO4基因組上野生型macAB基因發(fā)生同源重組,成功構(gòu)建PO4△macAB缺失株。同時利用PCR方法對突變株進行鑒定。突變株的血清型、生化特性及