靶序列模擬技術(shù)在抗CMV中的作用研究.pdf

1、黃瓜花葉病毒(CMV)是危害最為嚴(yán)重的植物病原之一，越來越多地被作為模式病毒用于植物與病毒的互作研究。由于抗性基因的缺乏，使得該病毒的防治工作收效甚微。至今，抗CMV病毒研究工作主要集中在轉(zhuǎn)基因表達(dá)病毒來源的蛋白或基因部分序列，或者表達(dá)CMV的衛(wèi)星RNA。因此，尋找更為有效地抗病毒的方法和策略是防治植物病毒病的主要任務(wù)之一。本論文利用最近報(bào)道的靶序列模擬技術(shù)(TargetMimicry，TM)，以CMV作為研究對(duì)象，探索該技術(shù)在抗植物病

2、毒中的可行性。
　　模擬靶序列是一種能被miRNA識(shí)別并互作的目標(biāo)序列，但不被miRNA切割。通過設(shè)計(jì)miRNA的模擬靶序列，并將其整合入病毒基因組，利用植物編碼的miRNA與模擬靶序列的結(jié)合，分析二者的結(jié)合對(duì)CMV的復(fù)制、翻譯和積累水平以及致病性的影響，明確靶序列模擬技術(shù)在CMV防治研究中的可行性。
　　首先，我們將miR159、miR162和miR170的模擬靶序列承載于含有報(bào)告基因GFP的CMV-GFPRNA3上，通過

3、浸潤接種侵染本氏煙。熒光觀察結(jié)果與Western印跡結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組的報(bào)告基因GFP熒光表達(dá)量均顯著弱于對(duì)照組?？梢?，內(nèi)源miRNA與其模擬靶序列結(jié)合抑制了病毒的積累。進(jìn)而，我們從病毒的負(fù)鏈合成及翻譯水平兩個(gè)方面分析靶序列模擬技術(shù)抑制病毒積累的作用層面。我們將miR162、miR164和miR170的模擬靶序列承載于非完整的CMV-GFPRNA3上，熒光觀察結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組的熒光量均明顯弱于對(duì)照組，說明內(nèi)源miRNA與其模擬靶序列結(jié)合顯

4、著抑制了蛋白的翻譯。我們提取樣品葉組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄出GFP的負(fù)鏈cDNA，經(jīng)PCR后的結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組的GFP負(fù)鏈含量均有不同程度的低于對(duì)照組，這說明miRNA與其模擬靶序列結(jié)合在一定程度上抑制了CMV負(fù)鏈的形成。最后，我們將模擬靶序列插入野生型CMV的各個(gè)基因組RNA上，通過Northem雜交檢測(cè)病毒各個(gè)基因組的積累量，結(jié)果顯示:模擬靶序列對(duì)完整病毒的積累具有不同程度的抑制作用。
　　綜上所述，通過本論文的實(shí)驗(yàn)研究，我們初步