PGPR菌株N2106在小麥根部的吸附機(jī)理和定殖動(dòng)態(tài).pdf

1、對(duì)小麥根際促生細(xì)菌AzotobacteT N2106進(jìn)行抗生素抗藥性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)N2106對(duì)Str具有抗性，對(duì)Tc敏感，通過(guò)三親本雜交將發(fā)光酶基因luxAB導(dǎo)入菌株N2106，獲得的標(biāo)記菌株N2106-L具有發(fā)光活性和對(duì)Km、Str、Tc三種抗生素的抗性，轉(zhuǎn)移頻率為（3.72±0.23）×10-5。將標(biāo)記菌株連續(xù)傳代15次，在LB平板上和含有3種抗生素的LB平板上，作影印對(duì)比點(diǎn)種試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)luxAB基因標(biāo)記的丟失率為9.8％，表明標(biāo)記菌株

2、具有較好的遺傳穩(wěn)定性。采用堿裂解法提取N2106-L中的質(zhì)粒，證明pTR102質(zhì)粒已成功地轉(zhuǎn)移到N2106菌株中，N2106-L菌株的生理生化特性并沒(méi)有受到luxAB基因?qū)氲挠绊?，同時(shí)測(cè)定出發(fā)菌株N2106和標(biāo)記菌株N2106-L的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線，發(fā)現(xiàn)菌株N2106-L的生長(zhǎng)沒(méi)有受到外源質(zhì)粒的影響，用N2106-L代替N2106進(jìn)行生態(tài)學(xué)研究是可行的。
　　 采用石油醚和丙酮脫脂、甲酸抽提、硫酸銨鹽析、熱處理、甲殼素親和層析的

3、方法分離純化麥胚凝集素（WGA），從小麥胚中純化的WGA的純化倍數(shù)為115.9，血凝活力為6.8 mg/L，產(chǎn)率為0.566 mg/g。WGA的糖結(jié)合試驗(yàn)表明，它的血細(xì)胞凝集活性可以部分地被D-葡萄糖、D-麥芽糖、D-果糖、蔗糖、N2106的胞外多糖和莢膜多糖所抑制，推測(cè)WGA可能影響定殖在小麥根際的促生細(xì)菌。為檢測(cè)WGA與其它根際細(xì)菌的親和性識(shí)別作用，用Marshall法對(duì)純化的WGA進(jìn)行異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記，用標(biāo)記的麥胚凝

4、集素對(duì)水稻和棉花根際細(xì)菌染色，發(fā)現(xiàn)水稻和棉花根際細(xì)菌與FITC標(biāo)記的麥胚凝集素的陽(yáng)性結(jié)合率分別為86.5％和5％。表明麥胚凝集素對(duì)不同的根際細(xì)菌具有不同的特異性識(shí)別作用。
　　 為研究細(xì)菌的莢膜多糖提取物對(duì)菌體的保護(hù)作用，將有莢膜和去莢膜的N2106-L細(xì)菌細(xì)胞置于極端環(huán)境下進(jìn)行成活率對(duì)比實(shí)驗(yàn)。結(jié)果，有莢膜的細(xì)菌細(xì)胞、無(wú)莢膜的細(xì)菌細(xì)胞、冷凍前添加莢膜多糖提取物的無(wú)莢膜細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)-34℃處理3d后，成活率分別為9.1％、2.1％、

5、4.0％。三種類型的細(xì)菌細(xì)胞在完全干燥情況下培養(yǎng)7d后，成活率分別為3.2％、2.1％、2.7％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明N2106-L的莢膜多糖提取物在一定程度上保護(hù)了細(xì)菌免受低溫冷凍、干燥等極端環(huán)境的損傷。
　　 細(xì)菌穩(wěn)定吸附到小麥根部是PGPR在植物根部成功定殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。將N2106-L和小麥共培養(yǎng)，研究了細(xì)菌對(duì)植物根的附著、吸附動(dòng)力學(xué)及等溫吸附。穩(wěn)定吸附發(fā)生在N2106-L菌株與小麥幼根接觸的瞬間，1min時(shí)，吸附量達(dá)到3.04×

6、107CFU/g，在吸附的前60min內(nèi)，吸附量呈線性增加（yⅡ=0.009x+7.5215（R2=0.9713）），以后逐漸達(dá)到最大值，增加到1.24×108CFU/g。從N2106-L的吸附動(dòng)態(tài)曲線可以看出，其吸附規(guī)律符合Langmuir吸附等溫線。經(jīng)計(jì)算，N2106-L在小麥根表的最大飽和吸附量qm=1.67x 10<'8>/g，吸附系數(shù)a =2.17x10<'-9>。有英膜細(xì)胞的吸附量是去英膜細(xì)胞吸附量的4.1倍(p=0.01)

7、，新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞與幼根相互作用更活躍，表明細(xì)菌的英膜在細(xì)菌和幼根的相互識(shí)別中也發(fā)揮了重要作用。添加WGA濃度至0.2mg/ml時(shí)，吸附量比對(duì)照增加了42％ (p=0.01)，當(dāng)小麥幼根用胞外多糖和英膜多糖提取物預(yù)處理后，吸附量比空白對(duì)照各下降了71％和48％勿=0.01)。
　　 以EUB338-cy3為探針，應(yīng)用FISH技術(shù)監(jiān)測(cè)了N2106-L在純培養(yǎng)的小麥根表的空間分布，明顯可見(jiàn)N2106-L在小麥根表的生物膜，而且清晰地觀

8、察到大量菌體吸附到小麥根毛和根表，且沿根表細(xì)胞縱向分布。將標(biāo)記菌株接種到滅菌和非滅菌的黃褐土、紅壤和黃潮土中研究其存活狀況，發(fā)現(xiàn)N2106-L在滅菌和非滅菌的三種土壤中均能長(zhǎng)期存活，并具有與土著菌株進(jìn)行空間和營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)的能力;在滅菌土壤中的數(shù)量稍高于非滅菌土壤;在三種土壤中的數(shù)量依次為:黃褐土>黃潮土>紅壤。
　　 采用根盒試驗(yàn)追蹤標(biāo)記菌株在小麥根圈的定殖動(dòng)態(tài)，發(fā)現(xiàn)N2106-L在小麥根表定殖密度大于根際定殖密度。在小麥根際，小麥

9、播種10d時(shí)標(biāo)記菌株在0-2cm深度根際土壤定殖達(dá)到最大值((2.17t0.25)x lO6CFLJ/g土，20d時(shí)在2-4cm深度的根際土壤中達(dá)到最高定殖水平((3.9210.47)x 105 CFU/g土;在小麥根表，標(biāo)記菌株在小麥播種lOd時(shí)在所有深度的根段均達(dá)到最高定殖水平，0-2cm根段定殖密度為((3.6010.60)x106CFU/g鮮根，12cm以下根段達(dá)到((2.7810.56)x104CFLJ/g鮮根。結(jié)果表明標(biāo)記菌