芝麻EST-SSR開(kāi)發(fā)、遺傳圖譜構(gòu)建及棉花脂肪酸代謝相關(guān)基因克隆.pdf

1、芝麻是重要的油料作物。與其他作物相比，芝麻的分子生物學(xué)研究剛剛起步，有關(guān)其圖譜構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因的研究還未見(jiàn)報(bào)道；棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，棉籽中富含蛋白質(zhì)和脂肪。近年來(lái)在棉纖維產(chǎn)量和品質(zhì)改良方面的分子生物學(xué)研究已取得較多成果，但在脂肪酸代謝基因工程改良棉籽油組分及植株抗寒性等方面的研究卻相對(duì)缺乏。為此本文開(kāi)展了芝麻分子遺傳圖譜構(gòu)建和棉花重要脂肪酸代謝相關(guān)基因的克隆研究。為今后芝麻標(biāo)記輔助選擇育種、QTL定位、圖位克隆、以及芝麻和棉花的轉(zhuǎn)基因育種

2、和比較基因組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下： 1、芝麻分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā) 鑒于在構(gòu)建芝麻分子遺傳圖譜時(shí)缺乏足夠的可利用分子標(biāo)記，本研究進(jìn)行了基于芝麻轉(zhuǎn)錄組和基因組的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)與研究工作，一方面，利用現(xiàn)有的芝麻EST(expressed sequence tags)數(shù)據(jù)信息，在分析其中SSR(simple sequence repeat)分布特征的同時(shí)，開(kāi)展芝麻EST-SSR功能性標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和利用研究，在所有的3328條芝麻E

3、ST序列中共確認(rèn)得到1785條非冗余EST序列。非冗余EST序列總長(zhǎng)為774.266kb，平均每3.06 kb含有一個(gè)EST-SSR。EST-SSR的分布頻率和特征分析表明，在所有≥18個(gè)核苷酸類型的重復(fù)基元中，二核苷酸重復(fù)基元出現(xiàn)的頻率最高(50％)，五核苷酸重復(fù)基元出現(xiàn)的頻率最低(2.2％).二核苷酸重復(fù)基元中又以AG/TC為重復(fù)基元(motif)的SSR出現(xiàn)最多，占總SSR的37.42％。利用含有SSR的EST序列，本文共設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)

4、了120對(duì)EST-SSR引物。另一方面，在分析前人發(fā)明的SAMPL標(biāo)記的基礎(chǔ)上，本研究開(kāi)發(fā)了一種可廣泛應(yīng)用于各物種的新型、高效的分子標(biāo)記，即RSAMPL(Random Selective Amplification of Microsatellite Polymorphic Loci)標(biāo)記。該標(biāo)記是AFLP標(biāo)記技術(shù)的延伸，在AFLP標(biāo)記技術(shù)最后的選擇性擴(kuò)增環(huán)節(jié)，采用一個(gè)AFLP引物與一個(gè)SSR引物來(lái)進(jìn)行組配擴(kuò)增.因該標(biāo)記中SSR引物的來(lái)

5、源既不受物種間限制，也不受SSR引物來(lái)源限制，其引物組合幾乎是無(wú)限的，可遍及整個(gè)基因組，作為一種新的標(biāo)記資源在基因組信息缺乏的物種中研究應(yīng)用。 2、芝麻分子遺傳圖譜的構(gòu)建 利用兩個(gè)不同來(lái)源的芝麻栽培品種(中油所品種1134和四川榮縣黑芝麻)組建了含96個(gè)單株的F2分離群體，通過(guò)EST-SSR、RSAMPL和AFLP標(biāo)記在親本及F2分離群體篩選，構(gòu)建了第一張芝麻分子遺傳圖譜。該圖譜包含30個(gè)連鎖群，220個(gè)分子標(biāo)記，標(biāo)記間

6、平均間隔為4.93cM，共覆蓋936.72cM的遺傳距離。連鎖群上的標(biāo)記數(shù)在2-33之間，平均每個(gè)連鎖群上有7.33個(gè)標(biāo)記。各連鎖群長(zhǎng)度在6.44-74.52cM之間，平均長(zhǎng)度為31.22cM。基于圖譜信息，本文首次對(duì)芝麻基因組的遺傳距離進(jìn)行估計(jì)，大小為1232.53cM，所構(gòu)建連鎖圖譜的基因組覆蓋率為76％。作為芝麻屬，同時(shí)也是胡麻科第一張的分子遺傳圖譜，該圖譜是芝麻基因組研究的起點(diǎn)，不僅對(duì)芝麻今后的基因組研究產(chǎn)生積極而深遠(yuǎn)的影響，而

7、且也為進(jìn)一步的圖位克隆、種質(zhì)創(chuàng)新和分子標(biāo)記輔助育種等研究提供可能。 3、棉花與脂肪酸代謝相關(guān)基因的克隆 在深入了解植物脂肪酸代謝網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上，本研究根據(jù)擬南芥、油菜等作物脂肪酸代謝關(guān)鍵酶基因的序列信息設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物在棉花cDNA中進(jìn)行同源克隆，并利用電子拼接和RACE技術(shù)，首次分離、克隆了七個(gè)在脂肪酸代謝過(guò)程中起重要作用的基因：(1)β-酮脂酰-ACP合成酶Ⅱ(KASⅡ)基因。該基因長(zhǎng)為2085bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)為1731

8、bp；共編碼576個(gè)氨基酸。BlastP結(jié)果顯示，該棉花序列與已報(bào)道的大豆(Glycinemax)、油菜(Brassica napus)、向日葵(Helianthus annuus)的β-酮脂酰-ACP合成酶Ⅱ(KASⅡ)分別有93％、91％和88％的同源性；(2)β-酮脂酰-ACP合成酶Ⅲ(KASⅢ)基因。該基因長(zhǎng)為1751bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)為1206bp；共編碼401個(gè)氨基酸。BlastP結(jié)果顯示，該棉花序列與已報(bào)道的蓖麻(Rici

9、nus communis)、紫蘇(Perilla futescens)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)的β-酮脂酰-ACP合成酶Ⅲ(KASⅢ)分別有89％、88％和85％的同源性。(3)ω-3脂肪酸脫飽和酶(ω-3FAD)基因。該基因長(zhǎng)為1905bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)為1341bp；共編碼446個(gè)氨基酸。BlastP結(jié)果顯示，該cDNA序列與已報(bào)道的煙草(Nicotiana tabacum)、向日葵(Helianthus

10、 annuus)和擬南芥(Arabidopsisthatiana)的ω-3脂肪酸脫飽和酶(ω-3 FAD)分別有84％、82％和78％的同源性。(4)甘油-3磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶(GPAT)基因。該基因長(zhǎng)為1845bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)為1503bp；共編碼500個(gè)氨基酸。BlastP結(jié)果顯示，該cDNA序列與已報(bào)道的擬南芥(Arabidopsisthaliana)和水稻(Oryza sativa(japoIuca cultivar-group)

11、)的甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)分別有91％和78％的同源性。(5)4-香豆素：CoA連接酶(4CL)基因。該基因長(zhǎng)為1909bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)為1725bp；共編碼574個(gè)氨基酸。BlastP結(jié)果顯示，該cDNA序列與已報(bào)道的茶(Camellia sinensis)、大豆(Glycine max)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)中的4-香豆素：CoA連接酶(4CL)分別有88％、87％和82％的同源性。(6

12、)脂酰-CoA氧化酶(ACX)基因。該基因長(zhǎng)為2268bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)為1995bp；共編碼664個(gè)氨基酸。BlastP結(jié)果顯示，該cDNA序列與已報(bào)道的番茄(Lycopersicon Esculentum)、葡萄(Vitis vinifera)和大豆(Glycine max)的脂酰-CoA氧化酶(ACX)分別有92％、92％和91％的同源性。(7)β-氧化多功能蛋白質(zhì)(MFP)基因。該基因長(zhǎng)為2455bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)為2166bp

13、；共編碼721個(gè)氨基酸。BlastP結(jié)果顯示，該cDNA序列與已報(bào)道的葡萄(Vtis vinifera)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa(japoIuca cultivar-group))的β-氧化多功能蛋白質(zhì)分別有89％、86％和83％的同源性。通過(guò)綜合比較分析，初步預(yù)測(cè)在上述基因中，基因1-4參與脂肪酸合成代謝，它們調(diào)控貯脂和膜脂的生物合成，可能在種子脂肪酸合成的效率和比例以及棉花