感染蕭氏松莖象綠僵菌菌株篩選及其致病機(jī)理研究.pdf

1、蕭氏松莖象是一種危險(xiǎn)性的松樹(shù)新害蟲(chóng)，其危害已成為林業(yè)生產(chǎn)的重要問(wèn)題，而綠僵菌是生物防治的主要病原真菌之一，本論文篩選出了對(duì)蕭氏松莖象致病力較強(qiáng)的綠僵菌Ma1291-2和MaWP-01菌株，系統(tǒng)研究了其生物學(xué)特性、致病機(jī)理及蕭氏松莖象對(duì)綠僵菌侵染的體液免疫反應(yīng)，并開(kāi)展了林間生物防治試驗(yàn)，為該害蟲(chóng)的生物防治奠定理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。 1.應(yīng)用10株綠僵菌菌株分別對(duì)蕭氏松莖象幼蟲(chóng)進(jìn)行致病力測(cè)定，結(jié)果表明，以濃度為(1.5±0.5)×106孢

2、子·mL-1的孢子懸液噴菌，7d后校正死亡率最高為91.90％，最低為15.28％，僵蟲(chóng)率最高為91.32％，最低為24.80％，LT50為5.39-10.12 d，單頭蟲(chóng)體平均產(chǎn)孢量為106-107孢子·頭-1。其中，Ma1291-2、MaWP-01和Ma1775菌株對(duì)蕭氏松莖象幼蟲(chóng)致病力較強(qiáng)，僵蟲(chóng)率分別為89.56％，91.32％和88.12％，LT50分別為5.49 d，5.72 d和5.53d，且都具有較高的僵蟲(chóng)蟲(chóng)體含孢量。通過(guò)

3、時(shí)間-劑量-死亡率模型參數(shù)估計(jì)發(fā)現(xiàn)，綠僵菌Ma1291-2和MaWP-01菌株對(duì)蕭氏松莖象幼蟲(chóng)的致死效應(yīng)較強(qiáng)的時(shí)間分別在第8d和第9d，處理的孢子濃度越高，其死亡高峰期越早。 2.利用12株金龜子綠僵菌菌株分別對(duì)蕭氏松莖象成蟲(chóng)進(jìn)行致病力測(cè)定，并選擇致病力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行林間感染試驗(yàn)，結(jié)果表明：Ma1291-2菌株對(duì)蕭氏松莖象的致病力最強(qiáng)，其次是MaWP-01菌株。以濃度(1.5±0.5)×108孢子·mL-1接菌，30 d后，Ma

4、1291-2菌株處理其校正死亡率、僵蟲(chóng)率和僵蟲(chóng)蟲(chóng)體含孢量分別為70.59％、70.81％和(1.90±0.34)×108孢子·頭-1，致死速度最快，LT50為13.89 d；MaWP-01菌株處理其校正死亡率和僵蟲(chóng)率分別為70.02％和69.79％，LT50為15.98 d。通過(guò)時(shí)間-劑量-死亡率模型參數(shù)估計(jì)發(fā)現(xiàn)，綠僵菌Ma1291-2菌株對(duì)蕭氏松莖象成蟲(chóng)的致死效應(yīng)較強(qiáng)的時(shí)間在16-18 d，處理的孢子濃度越高，其死亡高峰期越早。兩菌株

5、林間感染試驗(yàn)，蕭氏松莖象校正死亡率分別為(57.85±1.19)％和(44.35±2.91)％?？梢?jiàn)，Ma1291-2和MaWP-01菌株對(duì)蕭氏松莖象幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)均有較強(qiáng)的致病力，有較大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。 3.5種常用培養(yǎng)基中，Ma1291-2和MaWP-01菌株在PPDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)最快、產(chǎn)孢量最高。以葡萄糖為碳源，蛋白胨或酵母浸膏為氮源兩菌株的產(chǎn)孢量較高：Ma1291-2菌株孢子萌發(fā)最適宜的碳源是葡萄糖，MaWP-01菌株孢子

6、萌發(fā)最適宜的碳源是葡萄糖和可溶性淀粉。兩菌株的孢子萌發(fā)較好的氮源是蛋白胨和牛肉膏。在溫度25℃-28℃范圍內(nèi)，兩菌株產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)率都最好。在相對(duì)濕度90％以上，兩菌株的孢子都有較高的萌發(fā)率。光照對(duì)兩株菌株的產(chǎn)孢和萌發(fā)都較大的抑制作用。 4.利用掃描電鏡對(duì)綠僵菌Ma1291-2菌株侵染蕭氏松莖象成蟲(chóng)的部位和侵過(guò)程進(jìn)行研究，結(jié)果表明，該蟲(chóng)主要侵染的主要部位是腹部。接菌后第2d，孢子已開(kāi)始萌發(fā)，第3d，成功附著的孢子定向生長(zhǎng)產(chǎn)生芽管

7、，有的芽管末端膨大，侵染過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)有附著胞產(chǎn)生；第4-5 d，孢子定向生長(zhǎng)的同時(shí)產(chǎn)生菌絲；接菌后第8d，剛死亡的蟲(chóng)體體表出現(xiàn)新的菌絲及分生孢子；接菌后第9-10 d，未保濕培養(yǎng)的致蟲(chóng)體布滿(mǎn)菌絲，并產(chǎn)生大量分生孢子，為再侵染提供了條件。 5.探討蕭氏松莖象成蟲(chóng)血淋巴細(xì)胞對(duì)綠僵菌Ma1291-2菌株侵染的免疫反應(yīng)，結(jié)果表明：綠僵菌的侵染誘導(dǎo)了其血細(xì)胞的濃度和行為的強(qiáng)烈免疫反應(yīng)。在侵染過(guò)程中，蕭氏松莖象的血淋巴細(xì)胞出現(xiàn)數(shù)量增多、聚集

8、形成結(jié)節(jié)、包囊和吞食等現(xiàn)象，最后血細(xì)胞黑化并受破壞而裂解。接菌后5-8 d，總血細(xì)胞濃度發(fā)生先升高后下降的強(qiáng)烈波動(dòng)變化，第7d達(dá)到最高峰，其濃度為(4.71±0.02)×104細(xì)胞·uL-1。蕭氏松莖象成蟲(chóng)的正常血淋巴中，漿血細(xì)胞、粒血細(xì)胞、珠血細(xì)胞、類(lèi)絳血細(xì)胞和原血細(xì)胞分別占總血細(xì)胞的數(shù)量比例為(34.46±0.16)％、(17.28±0.16)％、(8.54±0.40)％、(5.01±0.32)％和(4.90±0.05)％，但漿血細(xì)

9、胞、粒血細(xì)胞和珠血細(xì)胞濃度都在接菌后6-10 d發(fā)生急速上升后下降的波動(dòng)變化，而原血細(xì)胞濃度在接菌后第6d極顯著下降，類(lèi)絳血細(xì)胞濃度波動(dòng)變化較小。 6.蕭氏松莖象幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)血細(xì)胞裂解液中酚氧化酶活性都極顯著高于血漿，分別是血漿中的2.04和1.91倍：幼蟲(chóng)血細(xì)胞裂解液中酚氧化酶活性最高，是成蟲(chóng)的1.52倍。經(jīng)不同致病力菌株的菌絲裂解液激活后，幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)血淋巴中的酚氧化酶活性都明顯增強(qiáng)，但隨著菌株致病力的增強(qiáng)，其對(duì)酚氧化酶原的激活

10、作用減弱。無(wú)致病力Ma20菌株的菌絲裂解液激活后，其酚氧化酶活性最強(qiáng)。在侵染過(guò)程中，幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)血淋巴中的酚氧化酶活性分別在接菌后的3-4 d和8-10 d最強(qiáng)。 7.綠僵菌油劑不僅孢子萌發(fā)率較穩(wěn)定，低濕環(huán)境下萌發(fā)率較高，對(duì)高溫適應(yīng)性較強(qiáng)，而且有利于孢子吸附昆蟲(chóng)體表，增強(qiáng)其對(duì)害蟲(chóng)的致病力。經(jīng)室內(nèi)培養(yǎng)48 h后Ma1291-2和MaWP-01菌株的分生孢子在油劑中(食用調(diào)和油V：柴油V=3：7)的萌發(fā)率達(dá)80％以上，應(yīng)用該兩菌株的油

11、劑進(jìn)行超低容量噴菌林間感染和防治試驗(yàn)，結(jié)果表明：感染試驗(yàn)中，2種油劑處理，蕭氏松莖象死亡率都極顯著高于對(duì)照；Ma1291-2和MaWP-01菌株油劑防治后1a，蕭氏松莖象蟲(chóng)口密度都極顯著低于對(duì)照，防治效果分別為(46.71±1.28)％和(37.57±1.26)％，防治后2a，蟲(chóng)口密度仍然顯著低于對(duì)照，防治效果分別為(45.47±1.70)％和(36.69±0.90)％。說(shuō)明該2株菌株的油劑對(duì)蕭氏松莖象有一定的控制效采，且Ma1291-

12、2菌株在該蟲(chóng)生物防治中更有應(yīng)用價(jià)值。 8.鑒于蕭氏松莖象成蟲(chóng)有晝夜上下樹(shù)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)的習(xí)性，利用綠僵菌Ma1291-2菌株無(wú)紡布菌條進(jìn)行感染和林間防治試驗(yàn)，結(jié)果表明：感染試驗(yàn)中，蕭氏松莖象校正死亡率和僵蟲(chóng)率分別為64.25％和62.25％，LT50為14.43 d；林間防治試驗(yàn)中，2個(gè)試驗(yàn)區(qū)效果分別達(dá)(53.80±1.74)％和(51.54±1.35)％。林間無(wú)紡布菌條上的含孢量15 d前為107-108孢子·cm-2，以后急速下降