豚鼠妊娠母體和胎兒卵巢發(fā)育及PCNA和Caspase-3表達(dá)特性研究.pdf

1、豚鼠是進(jìn)行人類和家畜生殖生物學(xué)研究的良好實驗動物模型，但是有關(guān)妊娠期豚鼠卵巢發(fā)育以及胎兒卵巢發(fā)生發(fā)育的組織形態(tài)學(xué)及其相關(guān)機(jī)制的報道很少。本研究采用人工授精技術(shù)獲得妊娠母鼠，進(jìn)而在妊娠期不同時間點(diǎn)(30、40、50、60、68天和出生后1天)采用組織學(xué)、免疫組織化學(xué)和免疫印跡分析等手段深入分析妊娠母鼠和胎兒豚鼠卵巢發(fā)育的形態(tài)學(xué)變化以及細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡標(biāo)記物的定位和相關(guān)蛋白信號的變化，力圖闡明妊娠母鼠和胎兒豚鼠卵巢發(fā)育的規(guī)律和這一過程中細(xì)

2、胞增殖和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白信號作用機(jī)制，為人類和家畜繁殖學(xué)提供理論基礎(chǔ)。
　　1.在本研究中，通過觀察胎兒期30、40、50、60、68天和出生后1天的豚鼠卵巢細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)從妊娠期30天到出生后1天卵巢中的卵泡發(fā)育存在動態(tài)變化。研究結(jié)果還顯示，妊娠期40～50天是豚鼠胎兒卵巢卵泡發(fā)育的關(guān)鍵時期。此外，當(dāng)采用細(xì)胞增殖的標(biāo)記——增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和細(xì)胞凋亡的標(biāo)記-caspase-3進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)PCNA主要是

3、在健康卵泡中表達(dá)，而caspase-3則主要在閉鎖卵泡中表達(dá)。結(jié)果表明:豚鼠的卵泡發(fā)生和發(fā)育發(fā)生在胎兒時期，這不同于常用的實驗動物大鼠和小鼠，因此，豚鼠可以為研究人類和家畜進(jìn)行胎兒和新生兒卵巢的卵泡形成，發(fā)育和閉鎖提供一個很好的動物模型。
　　2.在胎兒期豚鼠卵巢發(fā)育過程中，伴隨著顆粒細(xì)胞的增殖，原始卵泡大量出現(xiàn)，同時，大多數(shù)卵母細(xì)胞會不斷出現(xiàn)死亡，卵泡不斷閉鎖，這是細(xì)胞內(nèi)凋亡因素與抗凋亡因素共同作用的結(jié)果，因此需要深入分析其精確

4、機(jī)制。我們采用免疫印跡(WB)和灰度分析對胎兒期豚鼠不同時間點(diǎn)（胎兒期30、40、50、60、68天和出生后1天）細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡因素的變化進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在胎兒期30、40、50、60、68和出生后1天等不同時間點(diǎn)，p-Erk1/2與細(xì)胞周期蛋白CyclinD的表達(dá)逐漸升高在妊娠期60天時達(dá)到最高，然后開始下降(Pb，Pc＜0.05，Pd，Pe＜0.01);而進(jìn)一步對細(xì)胞凋亡因素分析，凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3與Bax的表達(dá)

5、在妊娠期50天逐漸升高，妊娠期68天和出生后1天持續(xù)高表達(dá)(Pb，Pc＜0.05)。因此，在胎兒期豚鼠卵巢發(fā)育過程中，細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡的共同作用調(diào)控了卵巢的發(fā)育。
　　3.妊娠期是從受精開始到分娩為止的一段時間，是新生生命在母體內(nèi)生活的時期，在這一時期，卵巢并未呈現(xiàn)靜止?fàn)顟B(tài)而是保持著與發(fā)情周期不同的卵泡發(fā)育。本研究采用組織學(xué)和免疫組織化學(xué)方法觀察妊娠期豚鼠卵巢其細(xì)胞增殖與凋亡。結(jié)果顯示:在胎兒期不同時間點(diǎn)（30、40、50、60

6、、68天和出生后1天）母鼠卵巢的卵泡發(fā)育并未停止，除了在卵巢上觀察到發(fā)育的黃體外，在卵巢上均有各級卵泡，而且，在卵巢上還存在大量的閉鎖卵泡。細(xì)胞增殖標(biāo)記物PCNA以及細(xì)胞凋亡標(biāo)志物caspase-3主要定位于各級卵泡諸如初級卵泡、次級卵泡、三級卵泡早期的顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞中，但未發(fā)現(xiàn)在卵母細(xì)胞中定位，此外，在卵巢間質(zhì)細(xì)胞中PCNA和caspase-3表達(dá)顯著。但是caspase-3定位于少量黃體細(xì)胞中。本研究證實在妊娠期母鼠卵巢出現(xiàn)的卵泡

7、發(fā)育與閉鎖與細(xì)胞的凋亡、增殖密切相關(guān)。
　　4.為了研究PCNA、caspase-3蛋白在豚鼠老年卵巢卵泡發(fā)育過程中的作用，取60月齡老年豚鼠的卵巢組織樣，采用免疫組織化學(xué)方法對其在豚鼠卵巢中的表達(dá)進(jìn)行了細(xì)胞定位，結(jié)果表明:在老年豚鼠卵巢中，caspase-3主要在卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞以及間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，不過相對于顆粒細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞中caspase-3的表達(dá)較多，此外，黃體細(xì)胞中caspase-3也有表達(dá);PCNA在卵母細(xì)胞