鎘致大鼠肝BRL 3A細(xì)胞的毒性機(jī)理及NAC的保護(hù)作用.pdf

1、鎘(cadmium，Cd)是一種有毒的重金屬元素，易在體內(nèi)蓄積，鎘能夠誘導(dǎo)多種器官或組織損傷并導(dǎo)致相關(guān)功能喪失，包括腎臟、肝臟、肺臟、骨骼、心血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)。體內(nèi)外研究均證明，鎘可引起細(xì)胞凋亡、氧化損傷及DNA損傷，且凋亡與氧化應(yīng)激、線粒體損傷、促分裂原激活蛋白激酶(MAPK)、死亡受體、Caspase及非Caspase依賴性通路的激活密切相關(guān)。肝臟是鎘損傷的主要靶器官之一，目前對(duì)鎘致肝細(xì)胞損傷研究較多，但其作用機(jī)制還不完全清楚。本

2、研究以大鼠肝細(xì)胞系BRL3A細(xì)胞為模型，采用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法研究鎘對(duì)BRL3A細(xì)胞的毒性作用機(jī)制及NAC的保護(hù)作用。研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.鎘致BRL3A細(xì)胞毒性損傷及NAC的保護(hù)作用
　　為研究鎘致BRL3A細(xì)胞的毒性損傷及NAC的保護(hù)作用，以0、10、20、40μmol/L醋酸鎘分別作用BRL3A細(xì)胞12h（分別為a-d組），同時(shí)以2mmol/L NAC、2mmol/L NAC(預(yù)孵育30min)+20μmol

3、/L醋酸鎘分別作用BRL3A細(xì)胞12h（為e-f組）。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率，比色法測(cè)定培養(yǎng)上清中LDH活性。結(jié)果表明，隨著鎘濃度的增加，細(xì)胞皺縮、變圓、結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞存活率逐漸降低(p＜0.01)，LDH釋放量顯著增加(p＜0.05); NAC單獨(dú)處理組細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞存活率和LDH釋放量與對(duì)照組差異不顯著(p＞0.05); NAC與鎘聯(lián)合處理組細(xì)胞形態(tài)皺縮，細(xì)胞存活率極顯著升高(p＜0.01)，上清

4、中LDH活性極顯著降低(p＜0.01)。表明NAC可有效保護(hù)鎘致BRL3A細(xì)胞的毒性損傷。
　　2.鎘致BRL3A細(xì)胞凋亡及NAC的保護(hù)作用
　　為研究鎘對(duì)BRL3A細(xì)胞凋亡的影響及NAC的保護(hù)作用，以0、10、20、40μmol/L醋酸鎘分別作用BRL3A細(xì)胞12h（分別為a-d組），同時(shí)以2mmol/L NAC、2mmol/L NAC(預(yù)孵育30min)+20μmol/L醋酸鎘分別作用BRL3A細(xì)胞12h（為e-f組）。

5、Hoechst33258熒光染色觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。結(jié)果表明，隨著鎘濃度的增加，細(xì)胞染色質(zhì)濃縮，有的呈新月形，甚至出現(xiàn)核碎裂;鎘致BRL3A細(xì)胞凋亡率顯著或極顯著升高(p＜0.01或p＜0.05);NAC單獨(dú)處理組細(xì)胞核狀態(tài)和凋亡率均與對(duì)照組差異不顯著(p＞0.05)，NAC與鎘聯(lián)合處理組細(xì)胞凋亡形態(tài)有所減少，凋亡率極顯著降低(p＜0.01)。表明NAC可有效降低鎘致BRL3A細(xì)胞的凋亡。
　　3.鎘對(duì)

6、BRL3A細(xì)胞DNA損傷的研究
　　為研究鎘致BRL3A細(xì)胞的DNA損傷，以0、10、20、40μmol/L醋酸鎘分別作用BRL3A細(xì)胞12h（分別為a-d組），通過(guò)單細(xì)胞凝膠電泳法測(cè)定細(xì)胞DNA損傷。結(jié)果表明，隨著鎘濃度的增加，受損細(xì)胞彗星率、拖尾長(zhǎng)度、尾部DNA含量均顯著或極顯著升高(p＜0.01或p＜0.05)。表明鎘可引起B(yǎng)RL3A細(xì)胞DNA損傷，并呈劑量一效應(yīng)關(guān)系。
　　4.鎘致BRL3A細(xì)胞氧化損傷及NAC的保護(hù)

7、作用
　　為研究鎘致BRL3A細(xì)胞的氧化損傷及NAC的保護(hù)作用，以0、10、20、40μmol/L醋酸鎘分別作用BRL3A細(xì)胞12h（分別為a-d組），同時(shí)以2mmol/L NAC、2mmol/L NAC(預(yù)孵育30min)+20μmol/L醋酸鎘分別作用BRL3A細(xì)胞12h（為e-f組）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，比色法檢測(cè)MDA含量及SOD、GSH-Px活性的變化。結(jié)果表明，隨著鎘濃度的增加，細(xì)胞ROS、MDA含量顯著或

8、極顯著升高(p＜0.01或p＜0.05)，SOD、GSH-Px活性顯著或極顯著降低(p＜0.01或p＜0.05);NAC單獨(dú)處理組細(xì)胞ROS、MDA含量及SOD、GSH-Px活性均與對(duì)照組差異不顯著(p＞0.05);NAC與鎘聯(lián)合處理組細(xì)胞ROS含量顯著降低(p＜0.05)，SOD、GSH-Px活性顯著或極顯著增高(p＜0.01或p＜0.05)。表明鎘致BRL3A細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，NAC具有明顯的效保作用。
　　5.鎘致BRL3A

9、細(xì)胞線粒體損傷及NAC的保護(hù)作用
　　為研究鎘致BRL3A細(xì)胞線粒體損傷及NAC的保護(hù)作用，以0、10、20、40μmol/L醋酸鎘分別作用BRL3A細(xì)胞12h（分別為a-d組），同時(shí)以2mmol/L NAC、2mmol/L NAC(預(yù)孵育30min)+20μmol/L醋酸鎘分別作用BRL3A細(xì)胞12h（為e-f組）。透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化，免疫熒光法檢測(cè)AIF、EndoG蛋白表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位，

10、比色法檢測(cè)Caspase3、Caspse9活性的變化，同時(shí)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡法檢測(cè)了Bax、Bcl-2的mRNA及蛋白，Caspse3、Caspase9及PARP的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，隨著鎘濃度的增加，線粒體數(shù)量減少、腫脹，嵴斷裂，發(fā)生空泡化，線粒體膜電位均極顯著降低(p＜0.01)，Caspase3、Caspase9活性顯著或極顯著升高(p＜0.01或p＜0.05)，Bax蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著增加，Bcl-2蛋

11、白及mRNA表達(dá)水平均顯著降低(p＜0.01)。Caspase3、Caspase9、PARP的蛋白表達(dá)量均顯著降低，Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase9的蛋白表達(dá)量則顯著增加;NAC單獨(dú)處理組細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)正常，Bax、Bcl-2、Caspase3、Caspase9、PARP蛋白與對(duì)照組無(wú)顯著差異;NAC的聯(lián)合應(yīng)用可有效抑制鎘致相關(guān)蛋白的變化的趨勢(shì)。鎘可使AIF、EndoG蛋白于線粒體和細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核。

12、表明Caspase和非Caspase途徑均參與了鎘致BRL3A細(xì)胞的凋亡，NAC可有效保護(hù)鎘致BRL3A細(xì)胞的線粒體損傷。
　　6.鎘對(duì)BRL3A細(xì)胞MAPK信號(hào)通路的影響及NAC的保護(hù)作用
　　為研究鎘對(duì)BRL3A細(xì)胞MAPK信號(hào)通路的影響及NAC的保護(hù)作用，以0、10、20、40μmol/L醋酸鎘分別作用BRL3A細(xì)胞12h設(shè)為a-d組（分別為a-d組），同時(shí)以2mmol/LNAC、2mmol/L NAC(預(yù)孵育30mi

13、n)+20μmol/L醋酸鎘分別作用BRL3A細(xì)胞12h（為e-f組）。另外，分別用10μmol/L p38抑制劑SB203580、JNK抑制劑SP600125、ERK抑制劑U0126預(yù)孵育0.5h后，加入醋酸鎘，使其終濃度20μmol/L作用12h。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，免疫印跡法檢測(cè)MAPK蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，10μmol/L SB203580、SP600125、U0126處理組細(xì)胞凋亡率均極顯著降低(p＜0.01)。鎘處理

14、均能使P-JNK、P-p38的蛋白表達(dá)量顯著增加，P-ERK在10-20μmol/L染鎘組蛋白表達(dá)量顯著降低，40μmol/L染鎘組44kD P-ERK的蛋白磷酸化水平并未顯著改變，42kD P-ERK的磷酸化水平則顯著增高。表明MAPK途徑參與了鎘致BRL3A細(xì)胞的凋亡，NAC可有效抑制MAPK途徑發(fā)揮一定的保護(hù)作用。
　　7.鎘對(duì)BRL3A細(xì)胞Fas/FasL信號(hào)通路的影響及NAC的保護(hù)作用
　　為研究鎘致BRL3A細(xì)胞

15、Fas/FasL信號(hào)通路的影響及NAC的保護(hù)作用，以0、10、20、40μmol/L醋酸鎘分別作用BRL3A細(xì)胞12h（分別為a-d組），同時(shí)以2mmol/L NAC、2mmol/L NAC(預(yù)孵育30min)+20μmol/L醋酸鎘分別作用BRL3A細(xì)胞12h（為e-f組）。比色法測(cè)定Caspase8的活性，免疫印跡法檢測(cè)Caspase8、FasL蛋白，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Fas、FasL mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果表明，隨著鎘濃度的