微藻對(duì)山羊瘤胃脂肪酸氫化和微生物區(qū)系及組織共軛亞油酸形成的影響.pdf

1、近年來，肉品質(zhì)量受到消費(fèi)者越來越大的關(guān)注，特別是肉中有益于人類健康的微量成分。長期攝入富含C12∶0、C14∶0、C16∶0等飽和脂肪酸反芻動(dòng)物產(chǎn)品易使血液中膽固醇水平提高，進(jìn)而導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生。共軛亞油酸（Conjugatedlinoleicacid;CLA）具有抗癌、預(yù)防心血管疾病的發(fā)生等生理功能。改善反芻動(dòng)物產(chǎn)品中脂肪酸組成，特別是提高CLA含量已成為當(dāng)今反芻動(dòng)物營養(yǎng)研究的熱點(diǎn)之一。因此，本文研究了富含二十二碳六烯酸(Doco

2、sahexaenoicacid;DHA)的海洋產(chǎn)品-微藻對(duì)山羊瘤胃發(fā)酵、生物氫化、組織中脂肪酸組成以及CLA合成關(guān)鍵酶硬脂酰-CoA去飽和酶(SCD)基因表達(dá)的影響。
　　1微藻DHA對(duì)瘤胃微生物體外發(fā)酵影響的研究
　　收集來自飼喂基礎(chǔ)日糧和基礎(chǔ)日糧+1％微藻的4頭山羊兩種瘤胃液（uRF和aRF），以羊草為發(fā)酵底物，體外發(fā)酵法研究兩種瘤胃接種物和微藻（0、100和200mgDHA/L）對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵特性的影響。結(jié)果表明，發(fā)

3、酵24h后，瘤胃液和微藻對(duì)所有的體外發(fā)酵參數(shù)均不存在交互作用;aRF較uRF相比顯著提高了發(fā)酵液中pH值、NH3-N和異戊酸的產(chǎn)量（P＜0.05），降低了24h累積產(chǎn)氣量和發(fā)酵液中丁酸、異丁酸及總VFA的產(chǎn)量(P＜0.05)，對(duì)丙酸凈產(chǎn)量有降低趨勢（P=0.06）;微藻顯著提高了24h累積產(chǎn)氣量和丙酸產(chǎn)量(P＜0.05)，對(duì)丁酸產(chǎn)量有提高趨勢（P=0.07）;對(duì)發(fā)酵特性的動(dòng)態(tài)結(jié)果表明，在整個(gè)培養(yǎng)期間，隨著發(fā)酵的推進(jìn)，所有處理組中累積產(chǎn)氣

4、量、發(fā)酵液中乙酸、丙酸、丁酸及總VFA濃度均隨著發(fā)酵時(shí)間而顯著增加(P＜0.05)，pH值顯著下降(P＜0.05)?？傊敬卧囼?yàn)結(jié)果表明，添加微藻可提高瘤胃微生物的發(fā)酵活力，但這種改變與瘤胃微生物的接種源有關(guān)。
　　2瘤胃灌注微藻對(duì)山羊瘤胃脂肪酸組成和瘤胃微生物菌群的影響
　　研究表明日糧添加微藻能夠抑制日糧中C18PUFA（主要為C18∶2n-6和C18∶3n-3）在瘤胃內(nèi)的生物氫化。而DHA對(duì)瘤胃內(nèi)主要的Butyriv

5、ibrio組氫化菌的抑制效果可能需要幾天或者幾周，因此我們推斷一些重要的氫化中間代謝產(chǎn)物可能在時(shí)間上會(huì)有變化。為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，選用6頭體重為18.40±0.95kg且裝有永久性瘤胃瘺管的閹割公山羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物，采用3×3拉丁方試驗(yàn)設(shè)計(jì)。羊草作為唯一粗料，試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)日糧處理，分別為對(duì)照日糧（對(duì)照組;Control），對(duì)照日糧添加6.10g/頭/天微藻(低劑量組(L-Alg);1.20gDHA/頭/天）和對(duì)照日糧添加18.30g/頭/天微

6、藻（高劑量組（H-Alg）;3.60gDHA/頭/天）。為防止日糧剩余，試驗(yàn)動(dòng)物均采用限飼，即按照每kg活體重飼喂69g日糧干物質(zhì)。日糧精粗比為40∶60。每期試驗(yàn)維持21天，期期間隔14天，于第0、3、7、14、20天采集瘤胃內(nèi)容物。瘤胃發(fā)酵結(jié)果表明:與對(duì)照組相比，H-Alg顯著提高了山羊瘤胃pH(P＜0.05)，降低了瘤胃TVFA(P＜0.05)，導(dǎo)致乙酸向丙酸和丁酸轉(zhuǎn)化，但L-Alg對(duì)山羊瘤胃發(fā)酵特性沒有顯著影響（P＞0.05）。

7、隨著微藻的灌注，高劑量組中（H-Alg）的乙酸比例（P=0.07）和丁酸比例（P=0.06）呈逐步下降或上升的趨勢，而丙酸比例則呈逐步上升（P＜0.05）。血清生化指標(biāo)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，瘤胃灌注微藻對(duì)山羊血清中葡萄糖、總蛋白、尿素氮、總膽固醇、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(VDL)、游離脂肪酸等濃度均無顯著影響（P＞0.10）。山羊瘤胃內(nèi)容物脂肪酸濃度（mg/gDM）分析結(jié)果表明:瘤胃灌注微藻線性增加了山羊瘤胃內(nèi)容物中C1

8、8∶1trans異構(gòu)體、C18∶2t9，t12，C18∶2t11，c15，DPA，DHA濃度(P＜0.001)，線性降低了瘤胃中C18∶0（P＜0.001）和CLAt10，c12濃度（P=0.03），C18∶2n-6和18∶3n-3濃度具有降低趨勢(P=0.09)，但對(duì)CLAc9，t11濃度無顯著影響（P＞0.10）。在試驗(yàn)的前3天，H-Alg導(dǎo)致瘤胃中C18∶1、C18∶2t9，t12，C18∶2t11，c15和DHA濃度顯著迅速提高

9、和C18∶0濃度的急劇降低，之后維持相對(duì)恒定的濃度水平。高劑量(H-Alg)中C18∶1trans濃度增加主要是由于C18∶1t11濃度的大幅提高。在試驗(yàn)的前三天內(nèi)C18∶1t11濃度迅速提高，之后繼續(xù)增加，在第20天時(shí)達(dá)到其最大值為4.53mg/gDM。而這些脂肪酸應(yīng)低劑量微藻灌注（L-Alg）則呈現(xiàn)出不同，其僅僅顯示過渡性變化。與對(duì)照組相比，H-Alg顯著降低瘤胃內(nèi)總細(xì)菌的數(shù)量(P＜0.001)，但對(duì)Butyrivibrio組菌數(shù)量

10、沒有產(chǎn)生影響(P=0.99)。瘤胃灌注微藻線性降低了瘤胃中C18∶0/(C18∶0+C18∶1t11)的比例（P＜0.001），表明18碳PUFA最后一步的氫化即C18∶1t11轉(zhuǎn)化為C18∶0受到大大抑制，然而C18∶0產(chǎn)生菌Butyrivibrioproteoclasticus數(shù)量并沒受到影響（P=0.24）。相關(guān)分析結(jié)果也表明，C18∶0/(C18∶0+C18∶1t11)比例與瘤胃內(nèi)Butyrivibrioproteoclasti

11、cus數(shù)量的相關(guān)性較弱(r=0.15，P=0.16)?？傊鑫腹嘧⒏邉┝课⒃?H-Alg)改變了瘤胃發(fā)酵模式，但低劑量(L-Alg)對(duì)瘤胃發(fā)酵沒有影響;瘤胃灌注微藻均抑制了日糧中C18PUFA的完全氫化特別是C18∶1向C18∶0轉(zhuǎn)化，但抑制效應(yīng)表現(xiàn)出不同:L-Alg僅僅呈現(xiàn)出過渡性抑制效應(yīng)，H-Alg導(dǎo)致急性抑制效應(yīng);同時(shí)本試驗(yàn)結(jié)果還表明，微藻對(duì)山羊瘤胃中C18PUFA氫化的抑制作用與目前已知可培養(yǎng)菌無關(guān)，可能與其他未知菌有關(guān)。

12、r>　　3日糧添加微藻對(duì)育肥期山羊生長性能、瘤胃及后腸道發(fā)酵的影響
　　試驗(yàn)選取10頭體重年齡相近的波爾×徐淮山羊雜交閹割育肥期公山羊，隨機(jī)分為兩組，分別飼喂基礎(chǔ)日糧（對(duì)照組）或基礎(chǔ)日糧+5.60g微藻的微藻日糧（微藻組:2.24gDHA/頭/天）60天，在第58、59和60天收集飼料樣品，第61和62天早晨飼喂后4-6h放血屠宰收集瘤胃、盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物，研究微藻DHA對(duì)育肥山羊生長性能和腸道發(fā)酵特性影響。結(jié)果表明，添加微藻對(duì)育

13、肥山羊采食量和平均日增重?zé)o顯著影響(P＞0.10)。瘤胃發(fā)酵結(jié)果表明，添加微藻顯著提高了瘤胃pH和丙酸濃度(P＜0.05)，顯著降低了乙酸濃度(P＜0.05)，對(duì)總VFA濃度有降低趨勢（P=0.09），但對(duì)丁酸濃度無顯著影響(P＞0.10)。結(jié)腸發(fā)酵結(jié)果表明，添加微藻顯著降低了總VFA、乙酸及丁酸濃度(P＜0.05)，但對(duì)丙酸無顯著影響(P＞0.10)。盲腸發(fā)酵結(jié)果表明，添加微藻對(duì)總VFA、乙酸、丙酸及丁酸等濃度未產(chǎn)生顯著影響（P＞0.

14、10）。以上結(jié)果說明，微藻對(duì)育肥期山羊的生長性能無顯著影響，改變了育肥山羊瘤胃瘤胃發(fā)酵模式，降低了結(jié)腸發(fā)酵能力，對(duì)盲腸發(fā)酵無影響。
　　4日糧添加微藻對(duì)育肥期山羊瘤胃脂肪酸組成和細(xì)菌菌群的影響
　　本研究試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)設(shè)計(jì)見試驗(yàn)3，于飼喂第61和62天時(shí)屠宰采集瘤胃內(nèi)容物，利用氣相色譜和16SrRNA基因克隆技術(shù)，研究日糧添加微藻對(duì)山羊瘤胃C18PUFA瘤胃氫化、細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及多樣性的影響。脂肪酸分析結(jié)果表明，添加微藻后抑制

15、了瘤胃中C18PUFA最后一步氫化:顯著提高了山羊瘤胃內(nèi)容物中C18∶1t11(5.45vs22.57g/100g總FAME)含量(P＜0.001)并伴隨C18∶0含量的(40.33vs2.96g/100g總FAME)顯著降低(P＜0.001)，但對(duì)CLAc9，t11含量沒有顯著影響（P＞0.05）。瘤胃細(xì)菌16SrRNA基因克隆庫結(jié)果顯示，對(duì)照組中61個(gè)陽性克隆(登錄號(hào):KC290727-KC290787)，可分為54個(gè)操作分類單元;

16、微藻組79個(gè)陽性克隆(登錄號(hào):KC290788-KC290866)，可分為61個(gè)操作分類單元?；赗DP序列分析表明，在兩個(gè)克隆庫中克隆數(shù)最多的是Prevotella，添加微藻改變了瘤胃細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)，增加了Prevotella(24.59％vs40.51％)、Butyrivibrio組菌(8.20％vs13.92％)、未分類Lachnospiraceae(4.92％vs11.39％)、未分類Veillonellaceae(1.64％vs

17、11.39％)以及未分類Porphyromonadaceae(3.28％vs7.59％)菌的比例，降低了未分類的Bacteroidales(21.31％vs3.80％)、未分類Bacteria(14.75％vs5.06％)及未分類Clostridiales(6.56％vs1.27％)菌的比例。對(duì)照組和處理組兩克隆庫中山羊瘤胃細(xì)菌Shannon、ACE、Chaol等多樣性指數(shù)分別為4.59vs4.36、632.85vs589.45及296

18、.27vs298.33。結(jié)果表明，微藻主要抑制了C18PUFA最后一步的氫化，改變了山羊瘤胃細(xì)菌區(qū)系組成;除Butyrivibrio組菌外，瘤胃中還存在其他未知菌在瘤胃氫化中發(fā)揮著更重要的作用如Prevotella、未分類的Bacteroidales、未分類Lachnospiraceae、未分類Veillonellaceae以及未分類Porphyromonadaceae。
　　5日糧添加微藻對(duì)育肥期山羊組織中脂肪酸組成及CLA合成

19、的影響
　　本研究試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)設(shè)計(jì)見試驗(yàn)3，于第61和62天早晨飼喂后4-6h放血屠宰采集肝臟、皮下脂肪和背最長肌等樣品，研究日糧微藻對(duì)山羊背最長肌肌內(nèi)脂肪和皮下脂肪脂肪酸組成和CLA合成的影響。脂肪酸分析結(jié)果表明，微藻顯著增加了育肥期山羊背最長肌肌內(nèi)脂肪和皮下脂肪中C18∶2t11，c15、DHA及n-3PUFA含量（P＜0.05），對(duì)C18∶0含量有降低趨勢（P=0.06;P=0.08）;對(duì)背最長肌肌內(nèi)脂肪和皮下脂肪中SFA

20、、PUFA、MUFA均沒有產(chǎn)生影響，但顯著降低了n-6/n-3比值，分別從6.11和6.38降為3.35和1.12(P＜0.05);添加微藻后C18∶1t11在背最長肌肌內(nèi)脂肪（1.07vs3.64g/100g總FAME）和皮下脂肪（2.29vs12.56g/100g總FAME）中的含量顯著提高（P＜0.05），同時(shí)CLAc9，t11含量相應(yīng)提高了0.75倍(0.24vs0.42g/100g總FAME)（P=0.13）和1.98倍（0.

21、42vs1.25g/100g總FAME）(P＜0.05);與瘤胃內(nèi)容物相比，背最長肌肌內(nèi)脂肪和皮下脂肪具有更高的CLAc9，t11/C18∶1t11比值（對(duì)照組:0.155、0.224、0.212;微藻組:0.043、0.114、0.111）(P＜0.05);相關(guān)性分析結(jié)果表明，C18∶1t11與CLAc9，t11在瘤胃（r=0.568，P=0.087）和肝臟(r=0.578，P=0.080)中的相關(guān)性較低，但在背最長肌和皮下脂肪中存在