復(fù)混肥中縮二脲對作物毒害的臨界值與縮二脲降解菌的研究.pdf

1、縮二脲是肥料中的一種對作物有毒害的物質(zhì)，已被大家所公認?？s二脲的產(chǎn)生是由于尿素生產(chǎn)過程中或作為生產(chǎn)復(fù)混肥料氮源的尿素在造粒過程中溫度過高縮合而成。肥料中過高的縮二脲含量使小麥、玉米等肥害事件屢次發(fā)生，經(jīng)濟損失嚴重。尿素質(zhì)量的國家標準（GB2440-91）對縮二脲含量有硬性要求，尿素中縮二脲含量大于1.5％時為不合格產(chǎn)品，但復(fù)混肥質(zhì)量標準中還沒有制定相關(guān)的限制性定量指標。
　　 目前縮二脲對作物造成的毒害作用還沒有比較好的解決方法

2、，傳統(tǒng)的補救措施是采用灌水排毒或耕耙分散毒素，使縮二脲濃度降低，補種或改種其它作物，最后補施一些優(yōu)質(zhì)氮磷鉀肥料。
　　 采用生物修復(fù)將縮二脲降解成無毒害作用的含氮化合物是一種有效的手段。土壤脲酶不能水解縮二脲，所以縮二脲在土壤中的降解速度很慢，好氧條件下5～8周內(nèi)只有15～21％的外加縮二脲能被轉(zhuǎn)化。但有關(guān)文獻表明反芻動物瘤胃培養(yǎng)條件下存在著脲酶以外的降解縮二脲反應(yīng)。本研究期望：1.找到復(fù)混肥中縮二脲對作物毒害作用的臨界值，為制

3、定復(fù)混肥國家標準提供數(shù)量化的科學(xué)依據(jù)。2.采用一種簡便的檢測方法從土壤中篩選出能夠高效降解縮二脲的菌株。3.對獲得的高效降解縮二脲菌株進行綠色熒光蛋白標記，跟蹤其在土壤中的定殖行為。
　　 通過水培和盆栽試驗方法對冬小麥、玉米、番茄、油菜、水稻五種供試作物耐縮二脲毒害作用的臨界值進行測定，在適宜的施肥條件下，水培試驗表明：1L水溶液中縮二脲含量大于35mg、40mg、20mg、15mg、15mg時，會對相應(yīng)作物生長造成顯著毒害。

4、盆栽試驗顯示：復(fù)混肥中縮二脲含量對相應(yīng)作物生長造成顯著毒害作用的臨界值為1.6％、2.0％、2.0％、2.0％、2.0％。考慮到氯離子等影響因素的存在，建議復(fù)混肥中縮二脲含量應(yīng)控制在1％以下。
　　 采用以縮二脲作為唯一氮源篩選出耐高濃度縮二脲的菌株，通過比對耐縮二脲菌株在添加和不添加縮二脲作為底物的無氮培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)初步確定是否利用縮二脲，最后結(jié)合發(fā)酵液中氨態(tài)氮的蒸餾滴定法以及發(fā)酵液中縮二脲含量的高效液相色譜定量分析法從新

5、疆農(nóng)大試驗田、河南焦作肥料廠、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)的供試土壤以及本實驗室保存的菌株中篩選到一株高效縮二脲降解菌，通過對菌株進行生理生化和16S rDNA序列分析，初步鑒定為克雷伯氏菌屬（Klebsiella），編號為GW-1。GW-1菌株在LB培養(yǎng)基、無氮培養(yǎng)基和以縮二脲為唯一氮源的無氮培養(yǎng)基上均可正常生長，在含縮二脲的無氮培養(yǎng)基上生長時7h進入對數(shù)生長期，其最適生長溫度為28℃，最適pH為7.10，大接種量和溶氧量能促進GW-1菌株的生

6、長，好氧條件下在縮二脲含量為500mg/L的無氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h后，GW-1培養(yǎng)上清液中縮二脲降解率達76.98％，34h時降解率達100％，GW-1菌株具有很強的縮二脲降解能力。
　　 通過三親結(jié)合對GW-1菌株成功進行了gfp基因標記，標記菌株編號為GW-1-GFP，通過對野生型菌株和標記菌株的形態(tài)學(xué)特征、質(zhì)粒圖譜、熒光檢測和降解縮二脲能力的比較，發(fā)現(xiàn)GW-1菌株已獲得gfp標記的質(zhì)粒，且標記菌株GW-1-GFP降解縮二脲

7、的能力與野生型菌株無明顯差別。
　　 GW-1-GFP菌株在發(fā)揮降解縮二脲功能的同時能夠在土壤中作物根際很好地定殖，隨著時間的推移，第45天時GW-1-GFP菌株在土壤中未被檢測到。未發(fā)現(xiàn)GW-1-GFP菌株對土壤中原有微生物的生長產(chǎn)生影響。發(fā)酵有機肥對GW-1-GFP菌株在土壤中的定殖有一定的促進作用，且明顯提高了土著微生物中芽孢桿菌數(shù)量。GW-1-GFP菌株接種作物種子試驗表明其與作物根部有很好的親和性，對作物生長也有很好的