除草劑中間體4-羥基苯氧基丙酸降解菌的分離鑒定及其降解途徑研究.pdf

1、農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的發(fā)展引發(fā)除草劑過度使用，由此而引發(fā)的環(huán)境污染問題日益受到人們的關(guān)注。低效率吸收的除草劑經(jīng)過雨水淋溶后，導(dǎo)致大量的土壤殘留。作為自然界廣泛存在的分解者，微生物以其多變的適應(yīng)能力扮演著重要的土壤生態(tài)修復(fù)工具的角色。因此，除草劑降解微生物的研究已成為熱點(diǎn)。作為近年來世界范圍內(nèi)大量使用的除草劑之一，芳氧苯氧丙酸類除草劑2011年的銷售額占據(jù)了全球農(nóng)藥市場(chǎng)的2.1％，占據(jù)全部除草劑市場(chǎng)的4.8％。雖然除草劑的施用降低了農(nóng)田雜草危害，但

2、是大量未吸收除草劑對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重的殘留污染。本研究以精惡唑禾草靈降解中間體(R)-(+)-2-（對(duì)羥基苯氧基）丙酸[(R)-(+)-2-(4-HydroxyPhenoxy)Propanoate，HPP]為基質(zhì)，從長(zhǎng)期受污染的化工廠污泥中分離和篩選降解微生物，并通過對(duì)降解微生物降解代謝和遺傳背景的研究，為此類除草劑污染的土壤生態(tài)修復(fù)和抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物的開發(fā)提供代謝研究基礎(chǔ)和微生物資源。
　　從長(zhǎng)期受污染的化工廠污泥中分離出能夠快

3、速降解HPP的三株菌，命名為MEPE0129，MEPE0902和MEPE0903。根據(jù)表型特征、生理生化特性及16SrRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析，分別將MEPE0129鑒定為紅螺菌科(Rhodospirillaceaegen.sp.)菌株，將MEPE0902鑒定為叢毛單胞菌科戴爾福特屬(Delftiasp.)菌株，將MEPE0903鑒定為產(chǎn)堿菌科的噬色素菌屬（Pigmentiphagasp.）菌株。MEPE0129，MEPE0902和MEP

4、E0903的生長(zhǎng)需要氧氣，最適生長(zhǎng)溫度均為37℃，最適生長(zhǎng)pH分別為6.0-7.0，7.0和7.0。當(dāng)NaCl濃度小于3％時(shí)，菌體生長(zhǎng)良好。
　　16SrRNA基因同源性比對(duì)表明，MEPE0129的16SrRNA基因序列與目前報(bào)道菌株最高同源性僅為91.17％。建樹分析后發(fā)現(xiàn)該菌在紅螺菌科內(nèi)形成了一個(gè)新的分支，該分支不同于科內(nèi)其他屬的模式菌株。進(jìn)一步對(duì)MEPE0129進(jìn)行了Biolog系統(tǒng)和API系統(tǒng)分析。同時(shí)分析了該菌株的脂肪酸

5、，G+Cmol％含量，極性酯，呼吸醌成分。MEPE0129DNAG+C含量為65.1mol％，主要呼吸醌為Q10(75％)，主要脂肪酸組分為C18∶1ω7c，C16∶0和C19∶0cycloω8c。與同科其他屬模式菌株比較后，發(fā)現(xiàn)MEPE0129擁有獨(dú)特的生理生化特征。因此建立以MEPE0129為模式種的新屬，命名為Taonellamepensis(=CICC10529T=CCTCCAB2012861T=KACC16940T)。

6、　　對(duì)MEPE0129，MEPE0902和MEPE0903分別進(jìn)行了以HPP為唯一碳源，最適溫度，最適pH，不同接種量，不同基質(zhì)初始濃度和不同金屬離子條件的降解實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MEPE0129可以在13d內(nèi)利用50mg·L-1生長(zhǎng)，最高生長(zhǎng)OD600nm可以達(dá)到0.1。MEPE0902可以在14h內(nèi)利用高達(dá)450mg·L-1的HPP進(jìn)行生長(zhǎng)，相應(yīng)的菌株生長(zhǎng)濁度OD600nm由0.027上升至0.53。MEPE0903可以在8天內(nèi)將50

7、mg·L-1的HPP降解96％，同時(shí)菌體干重上升至90mg·L-1。MEPE0129，MEPE0902和MEPE0903的最適降解溫度分別為28℃，37℃和30℃，其中MEPE0129在低于28℃的低溫條件下有顯著降解。三株菌的最適降解pH分別為8.0，7.0和8.0，且都在偏堿環(huán)境中有良好的降解效果。不同初始HPP濃度實(shí)驗(yàn)表明，高接種量的MEPE0129可以在6d內(nèi)降解125mg·L-1的HPP，MEPE0902可以在15h內(nèi)降解高達(dá)

8、500mg·L-1的HPP。而MEPE0903僅能降解50mg·L-1的HPP，在100mg·L-1及其以上濃度時(shí)，MEPE0903失去降解能力。不同初始接種量實(shí)驗(yàn)表明，在選定的接種量范圍內(nèi)，三株菌對(duì)于HPP的降解效率隨著接種量的升高而升高。金屬離子實(shí)驗(yàn)表明，Cu2+和Ni2+對(duì)于三株降解菌的降解有抑制作用，而Co2+對(duì)于MEPE0902的降解抑制作用更加顯著。
　　研究了MEPE0902中對(duì)苯二酚(HQ)的單獨(dú)降解，對(duì)苯二酚與H

9、PP的誘導(dǎo)降解，對(duì)苯二酚與HPP的混合降解和HPP降解的中間產(chǎn)物。在50mg·L-1對(duì)苯二酚的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，對(duì)苯二酚能被MEPE0902轉(zhuǎn)化為未知且無法利用的中間產(chǎn)物。對(duì)苯二酚和HPP的誘導(dǎo)和混合降解實(shí)驗(yàn)表明，兩種物質(zhì)對(duì)于對(duì)方的降解沒有顯著影響。最終，通過濃縮降解發(fā)酵液的方法，我們檢測(cè)到了中間產(chǎn)物對(duì)苯二酚，確定了HPP在MEPE0902中的降解是以微量對(duì)苯二酚為中間代謝產(chǎn)物的新型降解途徑。
　　為了研究MEPE0129和MEPE

10、0902中多種可能的HPP降解代謝途徑，分析了降解菌中的偏苯三酚開環(huán)酶活性。實(shí)驗(yàn)表明菌株MEPE0129和MEPE0902的破碎粗酶液具有偏苯三酚開環(huán)酶活性。利用保守引物以MEPE0129基因組DNA為模板擴(kuò)增，得到了MEPE0129中偏苯三酚開環(huán)酶基因片段。繼而通過Sefa-PCR和Tail-PCR側(cè)翼擴(kuò)增得到了6.8k的芳香族化合物降解基因簇。克隆了完整的MEPE0129偏苯三酚開環(huán)酶基因hppC，連接至pET-29a載體進(jìn)行表達(dá)。