文獻綜述--抗凍機制ice-cbf-cor途徑及抗凍相關蛋白的研究

1、<p>　　文 獻 綜 述</p><p>　　題 目： 抗凍機制ICE-CBF-COR途徑及抗凍相關蛋白的研究 </p><p>　　抗凍機制ICE-CBF-COR途徑及抗凍相關蛋白的研究</p><p>　　摘要：低溫對農(nóng)業(yè)的產(chǎn)生巨大的影響，特別是在對農(nóng)作物的品質和產(chǎn)量上。全球大部分農(nóng)作物種植區(qū)在北半球以北的溫寒帶地區(qū)，這些地區(qū)小麥

2、、玉米、水稻等主產(chǎn)農(nóng)作物，每年因低溫災害使得農(nóng)作物損失高達2000多億美元，加上環(huán)境日益惡化，氣候異常，低溫可能隨時侵襲冬季農(nóng)作物，損失將會更嚴重。如何提高農(nóng)作物的耐低溫能力進而提高農(nóng)作物品質與產(chǎn)量已經(jīng)成為研究的重點。目前，與植物抗凍性有關的分子生物學研究取得了很大進步，大量研究發(fā)現(xiàn)表明經(jīng)過冷馴化可誘導植物相關抗凍基因及其它調節(jié)因子的表達，進而提高植物的抗凍性?？箖鰴C制中ICE-CBF-COR途徑在提高植物抗凍性方面發(fā)揮著重要作用，并且

3、研究較多，本文介紹了ICE-CBF-COR的機制以及相關的抗凍蛋白研究概況。</p><p>　　關鍵詞： 低溫；抗凍；ICE-CBF –COR；抗凍相關蛋白 </p><p>　　植物機體細胞內的生物膜體系與植物抗凍性有密切關系。當寒冬來臨或是遇到驟然低溫時，非抗凍性植物細胞的生物膜會發(fā)生相變，使之液晶相變成凝膠狀態(tài)，并且使膜的結構破壞，結果在原生質膜上形成透性較大的非脂類的“洞穴”，成

4、為許多電解質自由出入的通道，細胞質內的溶膠因而大量排出，最終引起植物死亡。許多植物在遭受嚴寒前經(jīng)過一個緩慢的降溫過程，其抗冷性會逐漸提高，這一過程稱為冷馴化或冷鍛煉。冷馴化實質就是進過低溫信號轉導，植物調節(jié)自身以適應環(huán)境的過程。冷馴化可以在一定程度上該改變植物體內的一系列生理反應，通過外界環(huán)境溫度因子刺激植物的相關信號受體，經(jīng)植物本身的特有的信號傳導系統(tǒng)，進而調節(jié)植物抗凍蛋白和其它調節(jié)蛋白表達，非蛋白因子（IP3,ABA等）含量，從而提

5、高植物抗凍能力。在冷馴化中，根據(jù)基因表達的蛋白產(chǎn)物， 可將其分為兩大類蛋白，一類是具有直接保護細胞免受脅迫傷害的功能蛋白； 另一類是傳遞信號和調控基因表達的調節(jié)蛋白[1]。</p><p>　　傳統(tǒng)育種法在提高植物抗凍性上存在諸多缺點，因而利用轉基因技術定向提高植物的的某一功能是現(xiàn)代育種的重要方法，是當今研究作物育種研究的熱點。</p><p>　　植物抵御凍害的途徑主要有 2條: 一是避

6、免細胞內冰晶的形成和阻止冰晶的生長；二是維持細胞膜的結構穩(wěn)定性和蛋白質核酸的生物活性。因此，改造作物抗凍遺傳特性的分子生物學工作也主要是圍繞著這兩個方面進行的。對于抗凍蛋白(AFPs)及其基因的研究就是其中的一項重要內容.抗凍蛋白有抑制冰晶生長的作用，而且這種作用在不同的方向上有強弱之分，因而引起冰晶形態(tài)的改變。[2]</p><p>　　圖1. 低溫影響植物的過程</p><p>　　

7、圖2. 非依賴于ABA的非冷馴化機制中的ICE-CBF-COR途徑</p><p>　　抗凍基因ICE-CBF-COR途徑</p><p>　　在植物適應低溫脅迫的過程中，其體內發(fā)生了一系列分子水平的反應。這些反應按照有序的時空順序發(fā)生，相互聯(lián)系，形成了一整套低溫應答的分子機制。了解植物低溫應答的分子機制對列產(chǎn)存植物耐寒品種非常重要。在植物低溫應答的分子機制中，ICE-CBF-COR途徑研

8、究較為深入。</p><p>　　1.1冷調節(jié)基因（cold-regulated genes，COR）</p><p>　　低溫馴化可誘導大量蛋白質的合成，其中大多數(shù)既可對低溫作出快速反應，又能受脫落酸(ABA)和水脅迫的誘導，編碼這些蛋白的基因稱為冷誘導基因（cold-induced genes）或冷調節(jié)基因（cold-regulated genes or cold-responsive

9、 genes,cor）.目前已分離鑒定的冷誘導基因的植物主要有擬南芥、苜蓿、油菜、菠菜、馬鈴薯、大麥、小麥、水稻、黑麥。</p><p>　　冷調節(jié)基因（COR）的啟動子區(qū)域含有具有5個堿基核心序列CCGAC的脫水反應元素DRE (Dehydration responsive element)做為順式作用啟動子元素，能在低溫脅迫時激活COR基因的表達[3]。Masakazu H等將Cu2COR19轉入煙草，和對照

10、煙草植株相比較，轉基因植株電滲值較低、發(fā)芽率較高、抗凍性有所提高口[4]。在這些基因表達的產(chǎn)物中，一些已證實是有己知酶活性的蛋白，它們可能對提高抗寒性有一定程度的作用,如擬南芥冷誘導基因中的fad8基因[5]和大麥中的blt4基因[6]，它們分別編碼脂肪酸去飽和酶和一種脂肪遷移蛋白，通過這種脂肪酸去飽和酶或脂肪遷移蛋白改變質膜的組成以提高膜的冷穩(wěn)定性。</p><p>　　1.2轉錄因子CBF（C-repeat-

11、binding factor）</p><p>　　轉錄因子也稱反式作用因子，是能夠結合在某基因上游特異核苷酸序列上的蛋白質，活化后從胞質轉位至胞核，通過識別和結合基因啟動子區(qū)的順式作用元件,啟動和調控基因表達。一個典型的植物轉錄因子包括:DNA結合域、低聚糖位置、轉錄調節(jié)區(qū)域和一個核酸定位信號[7]。轉錄因子的研究時間已經(jīng)很久，但是有關轉錄因子CBF的研究在近些年來對植物抗逆研究方面中才有了突破性的進展。<

12、;/p><p>　　轉錄因子CBF是冷馴化過程中重要的轉錄因子，其作用是響應冷信號，是能結合到COR基因的DRE序列上,并快速啟動下游COR基因的表達的蛋白質.對CBF的研究是植物冷馴化研究的重要組成部分，因此，有人把轉錄因子CBF看作是當植物面臨低溫時能夠激活一些COR基因的開關[8]。CBF可與CRT(c—repeat)／DRE(Dehydration Response Element)元件結合。這2個元件均含C

13、CGAC核心序列，即LTRE(Low．temperature—responsive Element)元件。該核心序列普遍存在于冷誘導和脫水誘導基因的啟動子中，為這類基因的誘導表達所必需[9]。</p><p>　　Yamaguchi Shinozaki和 Shinozaki(1994)從RD29A基因的啟動子中鑒定出一個9bp(TACCGACAT)的DNA調控元件DRE(dehydration-responsiv

14、e element)，(Yamaguchi-Shinozak and Shinozal， 1994).同年，從COR15基因的啟動子中又鑒定出另一調控元件CRT(C-repeat，TGGCCGAC)(Tbata et al.，2000).這兩個元件均含有CCGAC核心序列，即LTRE(low-temperature-responsive element)元件 (Jiang et al.，1996).隨后證明，CRT/DRE或其核心序列普

15、遍存在于冷誘導和脫水誘導基因的啟動子中，為這類基因的冷誘導和脫水誘導表達所必需.</p><p>　　CBF轉錄因子廣泛存在于擬南芥、玉米、番茄、油菜、煙草、水稻和小麥等許多種植物中，并參與多種基因的表達，該基因家族的成員都含有60個左右氨基酸殘基組成的非常保守的DNA結合區(qū)(即AP2／ERF結構域)，這類蛋白根據(jù)結構又可分為5類：AP2類、DREB類、ERF類、RAV類及其他類型。而在有關不同植物種屬CBF基因

16、表達調控和功能的研究，對擬南芥的報道較為全面，對棉花以及其它作物的研究相對較少[10]。</p><p>　　Stockinger等采用酵母單雜交 (yeast one-hybrid)方法從擬南芥中分離出一個cDNA，其編碼產(chǎn)物能與CRT/DRE特異結合，且在酵母系統(tǒng)中可激活含有CRT/DRE作為上游激活子序列的報告基因的轉錄 (Stockinger et al.，1997).所以，此蛋白具有轉錄激活因子的作用

17、，被命名為CRT/DRE結合因子CBF1，Southern雜交結果表明，CBFI是一個單拷貝或低拷貝數(shù)基因.以包含CBFI編碼區(qū)的片段作為探針，從擬南芥文庫中又篩選獲得CBF2和CBF3基因(Medina et al., 1999; Liu et al.，2002).與此同時，在獨立進行的另一研究中，Liu等鑒定出5種DRE結合蛋白，其中DREBIA、DREBIB和DREBIC分別對應于CBF3、CBF1和</p><

18、;p>　　CBF2(Liu et al., 1998).3個CBF基因構成一個小基因家族，以CBFI-CBF3-CBF2的順序正向重復排列于擬南芥染色體IV短臂的72.8cm處，相互之間連鎖. CBF3位于CBF1下游3kb處，CBF2位于CBF1少下游7kb處 (Medina et al., 1999;Liu et al., 2002).在3個CBF基因的可讀框中都不含內含子，CBF1包含642個核苷酸，CBF2和CBF3各含有

19、651個核昔酸.3個可讀框的核苷酸高度同源，其相似性大于80%，其氨基酸序列的同源性在85%以上.核苷酸和氨基酸序列高度同源、在染色體上緊密連鎖以及轉錄方向相同等事實表明，3個CBF基因具有共同的起緣，可能是一個祖先基因連續(xù)重復兩次后，通過突變或群體中的選擇演變而成 (Medina et al.1999; Liu et al.，2002).</p><p>　　在正常生長溫度下，植物體內的CBF基因不表達，幾乎

20、檢測不到其轉錄物的存在.將擬南芥植株轉移到低溫環(huán)境中，3個CBF基因的轉錄在15min內明顯提高，在接下去的1~2h之間繼續(xù)提高，2h后開始下降，但在24h內仍然保持著比正常溫度下生長的植株中要高的水平.相反，在ABA處理和脫水脅迫條件下，沒有CBF轉錄物積累.與擬南芥中的情況一樣，油菜、小麥、黑麥和番茄中類似CBF基因的轉錄也在經(jīng)受低溫脅迫后 15~30min內快速提高，幾小時內達到最高，隨后開始下降 (Jaglo et al.，20

21、01).這些結果表明，CBF基因的表達為低溫特異誘導而不受ABA和脫水脅迫的調控.擬南芥中3個CBF基因冷誘導表達的模式相同，其轉錄物以非常相似的動力學過程積累 (Medina et al.， 1999).而且，CBF基因的這種冷誘導表達是非器官特異的，它們的轉錄物在葉、莖、根等器官中積累到相似的水平(Shinwari et al., 1998; Medina et al., 1999). CBF的表達受到了ICE1及HOS1等基因的

22、調控。</p><p>　　未經(jīng)冷馴化條件下，在-5~6℃環(huán)境中冷處理1-2d， 擬南芥野生型植株全部死亡或存活很少，而超表達CBF1或CBF3的轉基因植株仍保持相當高的存活率 (Jaglo-ottosen et al., 1998;Liu et al., 1998;Kasuga et al., 1999;Liu et al., 2002).</p><p>　　由于CBF轉錄激活因子可

23、以調控多個與植物干旱、高鹽及低溫耐性有關的功能基因的表達，所以利用CBF轉錄因子來改良植物抗逆性比起單純的使用下游的某種單基因來改變植物的抗逆性更可以獲得較為理想的綜合效果，這為基因工程改良植物抗逆性提供了一種全新的技術途徑，具有廣闊的應用前 [11] 。</p><p>　　1.3轉錄激活因子（inducer of CBF expression,ICE）</p><p>　　研究發(fā)現(xiàn)CB

24、F基因的表達調控是一個復雜的過程，CBF蛋白的翻譯需要其他因子的參與，因此，ICE因子得以發(fā)現(xiàn)。ICE是在低溫時誘導CBF家族表達的轉錄激活因子,它在低溫時能特定地結合到CBF的啟動子序列上,誘導CBF的表達,而后CBF結合到其下游目的基因啟動子的DRE序列上,誘導COR基因的表達，進而提高植株的抗凍性[12]。在已研究的ICE中，ICE1(inducer of CBF expression1)是直接調控CBF表達的上游信號。2003年

25、Viswarmthan等人分離得到ICE轉錄因子中的ICE1(inducer of CBF expression1) [13]。ICE1編碼含有一個bHLH(basic helix—loop—helix)結構域、具有DNA結合特征的MYC、MYB類蛋白，而上述蛋白通過bHLH結構域與MYCR／MYBR元件互作，誘導CBF基因的表達[14]。</p><p><b>　　二、抗凍相關蛋白</b>

26、;</p><p>　　植物的抗寒力與體內的抗寒基因所表達的抗寒蛋白密切相關，起主要作用的蛋白有兩種：（1）冷誘導蛋白： COR蛋白（Cold Regulated protein）等，在低溫誘導后產(chǎn)生的蛋白嵌入膜脂雙層或附著于膜表面，起穩(wěn)定膜結構的作用，（2）抗凍蛋白或重結晶抑制蛋白：AFPs（Antifreeze proteins）、IAPs(Ice-active proteins)或IRI（Ice recry

27、stallisation inhibition)蛋白等，吸附或附著于冰晶表面，改變冰晶形態(tài)并抑制冰晶的生長。</p><p>　　低溫誘導蛋白是植物在溫度逆境條件下誘導產(chǎn)生的一系列蛋白,抗凍蛋白(AFPs)是是其中之一[15]，其本身是一類抑制冰晶生長的蛋白質，能以非依數(shù)性形式降低水溶液的冰點，但對熔點影響甚微，從而導致水溶液的熔點和冰點之間出現(xiàn)差值，這種差值稱為熱滯活性（THA）或抗凍活性，差值越大，抗凍活性越

28、大[16]，抗凍蛋白亦稱為熱滯蛋白或溫度遲滯蛋白。最初發(fā)現(xiàn)的抗凍蛋白（AFPs）是從極區(qū)海魚中發(fā)現(xiàn)的, 在魚類和昆蟲類中研究較深入。有關植物（AFPs）的研究卻是最近些年才開始的，直到1998年，英國York大學的Daw等首次在胡蘿卜發(fā)現(xiàn)了AFPs及其基因[17]。Griffith 等[18] 明確指出, 在冷馴化的小麥(Triticum aestivum)中有內源AFPs的產(chǎn)生，U rrutia等[19]也在多種植物中發(fā)現(xiàn)了AFPs

29、的存在。</p><p>　　研究發(fā)現(xiàn), AFPs蛋白的一個顯著特征是具有熱滯活性, 即該蛋白能以非依數(shù)性形式降低水溶液的冰點而不影響水溶液熔點。AFPs能結合到冰核的表面抑制冰晶的生長, 避免冰晶所造成的細胞物理性損傷。研究還發(fā)現(xiàn)有些AFPs除了具有抗凍活性外, 還具有一些酶活性和抗菌、抗蟲活性。目前已克隆到的植物抗凍蛋白基因有黑麥草1117kD的AFP的cDNA[20]; 冬黑麥中3117kD的AFPs的CH

30、T基因,2418kD的AFPs的CHT46基因[21]等。其中來自冬黑麥中的這兩個抗凍蛋白基因，均已被轉化到大腸桿菌中，檢測結果表明，表達蛋白具有抗凍活性。</p><p>　　隨著植物抗凍機理方面的研究加深，目前，已在許多植物中觀察到抗寒蛋白的合成，新合成的抗寒蛋白有47 kD擬南芥抗寒蛋白[22]、39kD小麥抗寒蛋白[23]等，它們的共同性質是：熱穩(wěn)定性，富含甘氨酸、低芳香族氨基酸和高親水性氨基酸，可使蛋白

31、質保持高度的可伸縮性以保護細胞由于低溫引起的脫水作用。2002年Fan等人以胡蘿卜幼苗為材料，進行PCR擴增，克隆到1個1099 bp的基因，并鑒定為抗凍蛋白基因，將該基因連上CaMV 35S啟動子上，構建到pCAMBIA2300載體上并轉人煙草中，觀察發(fā)現(xiàn)在0℃條件下，轉基因煙草所受的凍害明顯低于對照煙草[24]。這表明植物具有類似于魚類的降低冰點、修飾冰晶形態(tài)和抑制冰重晶化等特性，在提高細胞在冰凍脅迫下的抗結冰能力中起著重要作用。2

32、008年，王艷等將鱉甲抗凍蛋白基因mpAFPl49轉入煙草中[25] ，低溫處理2d，發(fā)現(xiàn)轉基因煙草的抗凍性明顯優(yōu)于野生型，并且當溫度恢復到室溫后，轉基因煙草恢復生長，而野生型煙草卻因受到不可逆的低溫凍害而停止生長。</p><p>　　在2010的最新報道中，Chunzhen Zhang等人發(fā)現(xiàn)經(jīng)過冷馴化后重，重結晶結晶抑制蛋白（IRI）中的 LpIRI-a 和LpIRI-b增強了宿主細胞的抗凍能力[26]

33、。除了上述兩類蛋白與植物的抗凍相關外，Zhi-Yan Du等發(fā)現(xiàn)ACBPs蛋白的過表達，使得植物中的二不飽和的甘油酯卵磷脂減少，植物抗凍性提高[27]。</p><p>　　目前從植物中分離克隆并能夠用于轉化的植物抗凍蛋白基因并不多，并且不同植物的抗凍蛋白的DNA和氨基酸序列幾乎沒有同源性，因此今后關于植物抗凍蛋白基因的分離克隆將是植物抗寒基因工程研究的一個熱點[28]。植物的抗凍性是在長期進化中逐漸形成的，不同

34、的氣候環(huán)境植物的抗寒能力不同。植物冷馴化過程發(fā)生一系列生理反應。Peter A. Gorsuch（2010）通過實時反轉錄聚合酶鏈反應（RT - PCR法），發(fā)現(xiàn)經(jīng)低溫處理過的成長葉片中CBF1含量增多，同時其它的基因的轉錄及翻譯蛋白的含量也都有明顯變化，說明低溫可誘導從基因翻譯到蛋白等一系列復雜環(huán)節(jié)[29]。</p><p><b>　　三、存在問題及展望</b></p>&

35、lt;p>　　在地球環(huán)境日益惡化的過程中，氣候環(huán)境變化變得更加復雜，寒冷氣候變化變得更加無規(guī)律，而當今世界的種植面積又在與日劇減，糧食基礎是人類一切活動的前提。為此，唯有提高農(nóng)作物的產(chǎn)量、品質才能解決人類的糧食總量與耕地少的問題。因此提高植物的抗凍性，培育抗凍作物品種對于農(nóng)業(yè)有十分重要的意義。而這些的實現(xiàn)需要以基因工程為基礎，需要更多的科技人員投入到其中。提高植株的尤其是農(nóng)作物的抗性已成為全球研究的重點之一。在植物抗凍領域方面，植

36、物基因工程的理論和技術體系已基本建立，但目前還不夠完善，就目前存在以下問題</p><p>　　(1)關于農(nóng)作物的抗凍性的研究主要集中在水稻、小麥等一些作物上，對于其他的作物的抗凍基因、抗凍蛋白及相關影響因子的研究較少，要建立更加全面的農(nóng)作物的抗凍機理、信息，還需要更多的研究</p><p>　　(2)抗寒能力強弱由植物的基因決定，而植物的抗凍性狀一般受多基因控制。已分離鑒定出許多與低溫脅

37、迫有關的基因及其產(chǎn)物，但其具體功能尚需進一步研究。低溫脅迫下植物的響應是多基因表達產(chǎn)生的響應綜合，但并非是簡單累加，研究低溫響應相關基因間以及它們表達的關系，使這些基因的表達效應達到最高，提高植物耐寒能力，延長植物耐受低溫的時間，從根本上提高植物抗寒性?？傻蜏卣T導的基因很多且大多已被克隆和鑒定，應用分子生物學手段，植物低溫脅迫的響應生化和分子生物學機制正被逐步闡明，但仍有許多問題亟待研究，如低溫信號是如何被感知等。</p>

38、<p>　　(3)植物中AFPs蛋白，雖然能降低原生質溶液冰點以盡量避免植物體內形成冰晶、抑制冰晶的重結晶、修飾胞外冰晶的生長形態(tài)；調節(jié)原生質體的過冷狀態(tài)等。但是具體作用機制還不很清楚，需要更深的研究[30]。</p><p>　　(4)在將外源基因導入模制作物基因中時，要考慮到外源基因與內源基因是否相協(xié)調，即使是同源性高的植物間的外源基因對內源基因影響相對較少，但還是會出現(xiàn)轉基因植物出現(xiàn)的基因沉默問

39、題，同源關系遠的植物間的轉基因面臨的問題更多。今后有必要利用生物化學與分子生物學手段分離和克隆更為優(yōu)良的，適用于植物基因工程的抗凍蛋白基因，同時也需要對目前已獲得的抗凍蛋白在結構、功能上進行深人分析。盡管現(xiàn)在有關抗凍基因及轉抗凍基因植物方面的研究不多，但在不遠的將來一定會得到飛速的發(fā)展[31]。</p><p>　　(5)目前轉基因工程多限于在模式植物擬南芥中，這也就表明我觀察到抗凍性只能從單一模式作物擬南芥中獲

40、得，信息不全面。我們研究植物抗寒性的一個最主要原因是提高農(nóng)作物的抗寒性以增加其品質、產(chǎn)量，調整其種植地域。為此今后的更多研究應轉向農(nóng)作物開發(fā)方面。盡管現(xiàn)在有關抗凍基因及轉抗凍基因作物方面的成功報道還不多，但是，我們相信，在科研人員的努力下，在不久的將來，導入抗凍基因的植物將會得到飛速的發(fā)展，植物的抗凍機理，抗凍基因、抗凍相關蛋白、及其他影響因子之間的相互關系將會得到更進一步闡明。</p><p><b>

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