鳳尾蕨屬6種藥用植物抗腫瘤有效部位篩選

1、<p>　　鳳尾蕨屬6種藥用植物抗腫瘤有效部位篩選</p><p>　　作者：龔先玲，茍占平，梁念慈，劉義，李立</p><p>　　【摘要】 目的對鳳尾蕨屬6種藥用植物抗腫瘤有效部位進行篩選。方法采用MTT法對鳳尾蕨屬6種藥用植物不同溶劑萃取物進行體外抗腫瘤活性測試。結(jié)果半邊旗的醋酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物;刺齒半邊旗的石油醚萃取物、醋酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物;井欄邊草的醋

2、酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物;劍葉鳳尾蕨的醋酸乙酯萃取物;線羽鳳尾蕨的正丁醇萃取物對人肺癌細胞A549增殖均有明顯的抑制作用。結(jié)論上述鳳尾蕨屬幾種藥用植物的萃取物具有較好的體外抗腫瘤活性，是其抗腫瘤作用的有效部位。 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 鳳尾蕨屬; 抗腫瘤作用; 有效部位</p><p>　　Abstract：ObjectiveTo screen the active frac

3、tion with antitumor effect from 6 medicinal plants of Pteris L..MethodsThe samples of the 6 plants were extracted with ethanol at first, and then the ethanol extracts were separated with petroleum ether, ethyl acetate, n

4、-Butyl alcohol in turn to get three fractions. Then the antitumor effect of the extracts were tested with MTT method.ResultsEthyl acetate and n-BuOH extracts of Pteris semipinnta L., petroleum ether, ethyl acetate and n-

5、BuOH extracts of </p><p>　　Key words：Pteris; Antitumor effect; Active fraction</p><p>　　半邊旗藥材為來源于鳳尾蕨屬植物半邊旗Pteris semipinnta L.的干燥全草[1]。從中分離到的二萜類化合物5F、6F和A具有抗腫瘤作用[2,3]，其中5F含量較高，但活性不是很強，6F和A活性很強，但

6、其在原植物中的含量太低而不能開發(fā)利用。2006年由我們申報，半邊旗藥材被廣東省食品藥品監(jiān)督管理局批準為廣東省地方藥材標(biāo)準品種。根據(jù)藥用植物親緣學(xué)的原理，親緣關(guān)系相近的植物其所含化學(xué)成分相似，而化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的化合物其生理活性多相似[4]，因此，我們在研究半邊旗抗腫瘤作用的基礎(chǔ)上，對與半邊旗同屬的其他5種藥用植物的抗腫瘤藥效部位進行了篩選，以期發(fā)現(xiàn)抗腫瘤活性強的含量較高的二萜類化合物。</p><p><b&g

7、t;　　1 儀器與材料</b></p><p>　　1.1 儀器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，AE-240天平;NAPCO series 5400 CO2培養(yǎng)箱，Elx 酶標(biāo)儀(Bio-TEK- INSTUMENTS INC產(chǎn)品);96孔培養(yǎng)板(美國Costar)。</p><p>　　1.2 材料乙醇、醋酸乙酯、正丁醇(分析純);小牛血清(杭州四季青生物材料有限公司);RPMI 1640培養(yǎng)基

8、(GIBCO);二甲基亞砜(DMSO)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、胰蛋白酶、甲基噻唑藍(MTT)(美國Sigma公司)。半邊旗Pteris semipinnta L.采于廣州市郊，刺齒半邊旗P. dispar Kze.、井欄邊草P. multifida Poir.、劍葉鳳尾蕨P. ensiformis Burm.、蜈蚣草P. vittata L.采于廣東湛江，線羽鳳尾蕨P. linearis L.采于廣東東莞，由廣東醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)副教授茍

9、占平博士鑒定。人肺癌A549細胞株，由本實驗室傳代培養(yǎng)。</p><p><b>　　2 方法</b></p><p>　　2.1 實驗藥品的制備將采集的6種新鮮樣品半邊旗、刺齒半邊旗、井欄邊草、劍葉鳳尾蕨、蜈蚣草、線羽鳳尾蕨放于陰涼處晾干，粉碎。取上述6種粉碎的樣品各50 g，加乙醇500 ml，水浴回流提取2次，3 h/次，合并濾液，濾液減壓濃縮至干，浸膏加水溶解

10、，依次用石油醚(60～90℃)、醋酸乙酯、正丁醇萃取，將萃取物減壓濃縮至干，得到上述6種樣品的石油醚、醋酸乙酯、正丁醇干膏。以上18種干膏先用DMSO溶解，再加PBS溶解，精確配制成2400 μg·ml-1的儲存液(DMSO的體積分數(shù)=1%)，過濾除菌，放4℃冰箱備用。</p><p>　　2.2 細胞培養(yǎng)人肺癌A549細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清、100 kU·L-1 青霉素、100 mg&#

11、183;L-1 鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。</p><p>　　2.3 細胞增殖抑制試驗(MTT法) 取對數(shù)生長期的人肺癌細胞A549，用0.25%的胰蛋白酶消化，10% 新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)制成5×104個·ml-1的細胞懸液，接種于96孔板中，每孔接種100 μl。在37℃、5%、CO2條件下培

12、養(yǎng)過夜后，吸出培養(yǎng)液，加入新培養(yǎng)液180μl及藥液20 μl。待測樣品中DMSO終體積分數(shù)=0.1%，干膏樣品的終濃度分別為30，60，120，240 μg·ml-1，每個濃度平行6孔;培養(yǎng)72 h后，每孔加入5 mg·ml-1的MTT 20 μl，37℃， 5% CO2條件下溫育4～ 6 h，棄去上清液，每孔加入150 μl DMSO，在微型振蕩器上搖勻15 min，結(jié)晶溶解后，立即比色，在酶標(biāo)儀主波長為570 n

13、m，參比波長為630 nm處測量OD值，比色以空白孔調(diào)零。抑制率(%)=(1-實驗組6孔OD值平均值/對照組6孔OD值平均值)×100%。</p><p>　　2.4 統(tǒng)計分析采用SPSS11.0。</p><p><b>　　3 結(jié)果</b></p><p>　　3.1 鳳尾蕨屬同一植物不同提取部位對A549腫瘤細胞生長增殖的影響&

14、lt;/p><p>　　3.1.1 半邊旗各提取部位對體外培養(yǎng)的A549腫瘤細胞生長增殖的影響 半邊旗各提取部位的體外抗腫瘤活性顯示(表1)，其石油醚提取物、醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物在各個質(zhì)量濃度范圍對腫瘤細胞均有抑制作用;石油醚提取物對A549腫瘤細胞的增殖抑制有一定的劑量依賴性;而醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物對A549腫瘤細胞的增殖抑制呈明顯的劑量依賴性，在240 μg·ml-1時抑制作用非常明顯，

15、抑制率分別為88.55%，61.72%。</p><p>　　表1 半邊旗各提取部位對體外培養(yǎng)的A549腫瘤細胞生長增殖的影響</p><p>　　3.1.2 刺齒半邊旗各提取部位對體外培養(yǎng)的A549腫瘤細胞生長增殖的影響刺齒半邊旗各提取部位的體外抗腫瘤活性顯示(表2)，石油醚提取物、醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物在各個質(zhì)量濃度范圍對A549腫瘤細胞都有較強的抑制作用，在240 μg

16、3;ml-1時的抑制率分別為57.87%，77.15%，84.61%;且有明顯的劑量依賴性。</p><p>　　3.1.3 井欄邊草各提取部位對體外培養(yǎng)的A549腫瘤細胞生長增殖的影響井欄邊草各提取部位的體外抗腫瘤活性顯示(表3)，石油醚提取物、醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物在各個質(zhì)量濃度范圍對腫瘤細胞均有抑制作用;醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物在濃度為240 μg·ml-1時，對A549腫瘤細胞有明顯的

17、抑制作用，抑制率分別為65.06%和82.13%。</p><p>　　表2 刺齒半邊旗各提取部位對體外培養(yǎng)的A549腫瘤細胞生長增殖的影響</p><p>　　表3 井欄邊草各提取部位對體外培養(yǎng)的A549腫瘤細胞生長增殖的影響</p><p>　　3.1.4 劍葉鳳尾蕨各提取部位對體外培養(yǎng)的A549腫瘤細胞生長增殖的影響劍葉鳳尾蕨各提取部位的體外抗腫瘤活性顯示(表

18、4)，240 μg·ml-1的醋酸乙酯提取物對A549腫瘤細胞有較強的抑制作用，而此濃度的正丁醇提取物對A549腫瘤細胞的抑制率為15.25%，該濃度的石油醚提取物對A549腫瘤細胞的抑制作用僅為8.74%。</p><p>　　表4 劍葉鳳尾蕨各提取部位對體外培養(yǎng)的A549腫瘤細胞生長增殖的影響</p><p>　　3.1.5 蜈蚣草各提取部位對體外培養(yǎng)的A549腫瘤細胞生長增

19、殖的影響蜈蚣草各提取部位的體外抗腫瘤活性顯示(表5)，各提取部位對A549腫瘤細胞的抑制作用都較弱，石油醚提取物、醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物在240 μg·ml-1時，對A549腫瘤細胞的抑制率分別為24.60%，22.76%，14.29%。</p><p>　　表5 蜈蚣草各提取部位對體外培養(yǎng)的A549腫瘤細胞生長增殖的影響</p><p>　　3.1.6 線羽鳳尾蕨各提取部

20、位對體外培養(yǎng)的A549腫瘤細胞生長增殖的影響 線羽鳳尾蕨各提取部位的體外抗腫瘤活性顯示(表6)，其正丁醇萃取物對A549腫瘤細胞有較強的抑制作用，且呈一定的劑量依賴性;醋酸乙酯提取物對A549腫瘤細胞的抑制作用較弱，而石油醚提取物對A549腫瘤細胞的增殖在低濃度時有一定的促進作用，在240 μg·ml-1時的抑制率僅為2.49%。</p><p>　　表6 線羽鳳尾蕨各提取部位對體外培養(yǎng)的A549腫瘤細

21、胞生長增殖的影響</p><p>　　3.2 鳳尾蕨屬6種植物同一提取部位對A549細胞增殖影響的比較見圖1～3。</p><p>　　圖1 鳳尾蕨屬6種植物石油醚萃取部位對A549細胞增殖的影響</p><p>　　從圖1可以看出，當(dāng)藥物濃度為240μg·ml-1時刺齒半邊旗石油醚萃取物對A549細胞的增殖抑制作用最強，超過55%，依次為蜈蚣草石油醚萃取

22、物(抑制率近25%)，半邊旗石油醚萃取物(抑制率15%左右)，其余3種植物的該部位萃取物A549細胞的抑制作用更低，幾乎都在10%以下。</p><p>　　從圖2可以看出，當(dāng)藥物濃度為240μg·ml-1時，半邊旗醋酸乙酯萃取物對A549細胞的增殖抑制作用最強，其次為刺齒半邊旗醋酸乙酯萃取物，井欄邊草醋酸乙酯萃取物，劍葉鳳尾蕨醋酸乙酯萃取物，蜈蚣草醋酸乙酯萃取物，線羽鳳尾蕨醋酸乙酯萃取物，最后兩種的醋

23、酸乙酯萃取部位對A549細胞的抑制作用較低，在20%左右，其余幾種的該部位對A549細胞的抑制率均高于50%。</p><p>　　圖2 鳳尾蕨屬6種植物醋酸乙酯萃取部位對A549細胞增殖的影響</p><p>　　圖3 鳳尾蕨屬6種植物正丁醇萃取部位對A549細胞增殖的影響</p><p>　　從圖3可以看出，當(dāng)藥物濃度為240μg·ml-1時刺齒半邊旗

24、正丁醇萃取物對A549細胞的增殖抑制作用最強，其次為井欄邊草正丁醇萃取物，線羽鳳尾蕨正丁醇萃取物和半邊旗正丁醇萃取物，它們對A549細胞的抑制率均高于60%，而劍葉鳳尾蕨正丁醇萃取物和蜈蚣草正丁醇萃取物在該濃度時對A549細胞的抑制率均在15%左右。</p><p><b>　　4 討論</b></p><p>　　半邊旗具有較強的抗腫瘤作用，本實驗在研究半邊旗抗腫瘤

25、作用的基礎(chǔ)上，以人肺癌細胞A549為篩選模型，以抗腫瘤活性為指標(biāo)，較系統(tǒng)地對鳳尾蕨屬6種藥用植物不同提取部位進行了抗腫瘤活性的初步篩選。結(jié)果表明，半邊旗中抗腫瘤作用的物質(zhì)存在于醋酸乙酯部位、正丁醇部位，這與我們前面的篩選研究結(jié)果一致[5];刺齒半邊旗的抗腫瘤作用部位存在于石油醚部位、醋酸乙酯部位、正丁醇部位;井欄邊草中抗腫瘤作用的物質(zhì)存在于醋酸乙酯部位、正丁醇部位;劍葉鳳尾蕨中抗腫瘤作用的物質(zhì)存在于醋酸乙酯部位;線羽鳳尾蕨中抗腫瘤作用的

26、物質(zhì)存在于正丁醇部位;其他部位對A549細胞增殖抑制作用不明顯。值得注意的是，刺齒半邊旗石油醚萃取物在濃度為240μg·ml-1時其抑制率接近60%，而半邊旗石油醚萃取物在相應(yīng)濃度時其抑制率僅為15.12%;刺齒半邊旗醋酸乙酯萃取物在濃度為60μg·ml-1時其抑制率已超過50%，在濃度為120μg·ml-1時其抑制率已接近70%，而半邊旗醋酸乙酯萃取物在相應(yīng)濃度時其抑制率僅分別為19.92%和35.67%

27、;刺齒半邊旗正丁醇萃取物在濃度為60μg·ml-1時其抑制率已超過70%，井欄邊草正丁醇萃取物在濃</p><p>　　本課題組雖然對半邊旗中的抗腫瘤二萜類活性成分5F進行了深入的研究，但對其所含抗腫瘤活性比5F更強的6F和A卻由于含量低的原因未能進一步開發(fā)研究。本實驗的目的是確定與半邊旗同屬的其他植物的抗腫瘤活性部位，為下一步在活性作用的指導(dǎo)下，進一步發(fā)現(xiàn)抗腫瘤作用比5F更強的含量較高的二萜類化合物提

28、供研究基礎(chǔ)。</p><p><b>　　【參考文獻】</b></p><p>　　[1] 王玉生，蔡樂文. 南方藥用植物圖鑒[M]. 汕頭：汕頭大學(xué)出版社，2005：18.</p><p>　　[2] 張 曉，李金華，何承偉，等.半邊旗中二萜類化合物的植化及抗腫瘤活性初步研究[J].中國藥學(xué)雜志，1999，34(8)：512.</p&g

29、t;<p>　　[3] 戴 濱，崔 燎，吳 鐵，等. 半邊旗提取物5F抗腫瘤作用的實驗研究[J].四川中醫(yī)，2006，24(2)：10.</p><p>　　[4] 彭四保，彭 勇，陳士林，等.藥用植物親緣學(xué)[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2005，7(6)：97.</p><p>　　[5] 龔先玲，陳志紅，梁念慈.半邊旗提取物及化學(xué)成分抗腫瘤作用的研究[J].四川中醫(yī)